感染性疾病的检查【1】

感染性疾病的检查【1】
感染（infection）是病原体（pathogen）和人体在一定条件下相互作用的病理过程，感染的病原体包括各种细菌、病毒、寄生虫、真菌、支原体、衣原体、螺旋体等。

病原体的来源可分为外源性和内源性感染两种类型。

外源性感染是由于外界的病原体侵入人体，如志贺菌、结核分枝杆菌、人免疫缺陷病毒（HIV）等引起的感染。

内源性感染是人体内经常寄生的微生物，如大肠埃希菌、肠球菌、某些真菌等在一定条件下引起的感染。

感染后是否引起感染性疾病（infection diseases）与病原体的数量、毒力和人体的抵抗力有关，并决定感染的发生、发展和结局。

病原体感染后机体可以出现不感染、隐性感染（covert infection）、显性感染（overt infection）、持续性感染（persistent infection）或病原体携带状态（carrier state）几种类型。

感染性疾病是由于感染的病原体毒力强、数量多，超过了机体的抵御能力，定植在机体一定部位增殖、扩散或蔓延、释放毒素，引起机体免疫病理反应，导致组织、器官等损伤，生理功能紊乱，并出现一系列的临床症状和体征。

感染性疾病的检查主要包括病原体的检查、感染的血清学试验等，并由此确定感染性疾病的发生和性质；通过病原体的药物敏感试验、耐药株监测和医院感染的监测报告，为临床感染性疾病的最佳治疗药物选择，采取最有效的预防措施，防止感染的传播或流行提供及时、有效的实验数据。

随着现代社会与临床医学的发展，目前感染性疾病的流行病学特点发生了明显变化，主要体现在以下几个方面：①由强毒性病原体引起感染的疾病，如鼠疫、白喉、伤寒、天花、小儿麻痹逐渐减少或绝迹，而条件致病的病原体引起的感染、医院感染逐渐增多。

②由新的病原体、原有的病原体变异引起的新感染性疾病，如艾滋病（AIDS）、疯牛病、O157出血性肠炎、严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome, SARS）等陆续出现。

③以前的感染性疾病，如淋病、梅毒、结核病等又重新流行。

④多重耐药株，如耐万古霉素的肠球菌（VRE）、耐苯唑西林的葡萄球菌（MRS）、耐异烟肼的结
核杆菌等，导致抗感染治疗无效或低效。

因此，临床感染性疾病的检查应密切结合上述新的变化趋势进行。

细菌感染所致的感染性疾病占首位；病毒性感染在人群中的发生率最高，但不一定致病；真菌感染的发病率近年来显著上升；寄生虫，如隐孢子虫、卡氏肺孢子虫、滴虫等感染开始受到普遍关注。

病原体的检查是临床确诊感染性疾病的主要手段，根据需要鉴定到一定水平即可。

例如，作为临床病原学诊断，细菌感染只需鉴定到种，必要时才进一步鉴定；若进行流行病学调查，细菌鉴定应达到血清型或基因型。

临床病原体检查必须通过采集标本，经过各种试验后才能明确诊断。

标本采集质量的好坏直接影响诊断结果，早期采集、无菌采集、适当与适量采集是确保查明病原体的前提。

临床病原体检查的方法有多种，包括涂片检查、分离培养、血清学鉴定和分子生物学诊断（molecular biological diagnosis）等，可根据临床需要和标本类型进行选择。

临床标本分离培养的阳性结果最具确诊意义，但阴性结果并不能完全除外病原体感染的可能。

病原体抗原成分检测可早期、快速诊断感染性疾病，阳性结果表明感染病原体的存在。

分子生物学诊断为病原体感染的早期、快速、敏感、特异诊断成为可能，但应排除假阳性或假阴性结果。

目录
临床病原体检查的常用方法常见感染性疾病的病原体检查病原体感染的血清学诊断肝炎病毒感染标志物的检查性传播疾病的实验诊断获得性免疫缺陷综合征的检测严重急性呼吸综合征的实验诊断体外抗菌药物敏感性试验医院感染的类型及流行病学医院感染的微生物学监测
临床病原体检查的常用方法
㈠细菌感染的检查
1、涂片检查
临床标本或分离培养物涂片直接或染色后光学显微镜观察，可为进一步做生化反应、血清学鉴定等提供参考依据。

通过显微镜观察有无病原体及其大致数量，病原体形态、染色特征等，可以迅速作出初
步诊断，如痰中的抗酸杆菌和脑脊液中的脑膜炎奈瑟菌等。

⑴不染色标本的检查不染色标本一般用于观察细菌动力及运动情况，因为不染色标本直接在普通光学显微镜下，不能清楚看到细菌的形态与结构特征。

细菌未染色时呈无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境不同进行观察。

有鞭毛的细菌在镜下呈活泼有方向的运动，无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。

常用的方法有压滴法、悬滴法和毛细管法。

例如，在高倍暗视野显微镜下悬滴米泔样粪便，观察到来回穿梭似流星样运动的细菌；另制备一标本加入O1群霍乱弧菌诊断血清，若来回穿梭似流星样运动的细菌停止运动，为制动试验阳性，可报告疑为O1群霍乱弧菌。

⑵染色标本的检查
细菌标本经染色后，与周围环境在颜色上形成鲜明的对比，可在普通光学显微镜下清楚看到细菌的形态和某些结构。

常用的细菌染色法有：①单染色法只用一种染料将细菌和周围物体染成同一种颜色，称为单染色法。

如吕氏美蓝或稀释石炭酸复红染色法。

细菌经单染色法处理后，可观察其形态与排列、大小及简单的结构，但不能显示细菌染色特性。

②复染色法用两种或两种以上的不同染料进行染色，可将不同细菌或同一细菌的不同结构染成不同的颜色。

本法既可观察细菌的形态结构，还可根据染色反应及着色深浅鉴别细菌的种类，故又称鉴别染色法。

常用的有革兰染色法（Gram stain）和抗酸染色法(acid-fast stain)。

通过革兰染色，可将细菌分为革兰阳性（G+）和革兰阴性（G-）两大类，有助于缩小范围、初步鉴定细菌。

例如，在脑脊液涂片中发现G-的肾形、凹面相对的双球菌，且在吞噬细胞内或外，则可报告“脑脊液直接涂片找到革兰阴性双球菌，形似脑膜炎奈瑟菌”；若发现有革兰阳性双球菌，呈矛尖状、宽端相对尖端向外，且菌体周围有荚膜，则可报告“脑脊液直接涂片找到革兰阳性双球菌，形似肺炎链球菌”。

2、分离培养与鉴定采集临床标本在选择性或非选择性培养基分离培养，观察细菌的菌落形态、生化反应、毒素产生等，并用已知特异性抗体的免疫血清鉴定临床标本中或分离培养物中未知的细菌，
确定致病菌的属、种和血清型（血清学鉴定）等。

⑴分离培养：①增菌培养：由于标本中的细菌较少，用人工的方法提供生长繁殖所需的营养和最适条件，如温度、湿度和气体环境，使其迅速生长繁殖，使菌量增多，供进一步作纯培养或分离致病菌。

大部分细菌在24~48h内培养生长良好。

②分离培养：对于混有多种细菌的临床标本或其他培养物，经过划线接种到合适的选择性或非选择性固体培养基表面，因划线的分散作用，使许多原先混杂的细菌在固体培养基表面分离，一般经过18~24h培养后形成由一个细菌繁殖而来的细菌集团—菌落（colony），供细菌计数和纯培养用。

挑选单个菌落，转种至另一培养基中，生长出来的细菌均为纯种，称为纯培养（pure culture）。

分离纯培养是从临床标本中检查鉴定细菌非常重要的第一步，只有先从含有多种杂菌的标本中分离出目的菌纯培养，才能进一步对目的菌予以鉴定和研究。

⑵鉴定：根据纯培养细菌的染色形态、培养生长特性、生化反应和血清学试验结果，对分离培养的细菌作出鉴定。

目前，大多数临床细菌实验室多借助自动化细菌鉴定与药敏试验系统，可简便、快速、准确地鉴定各种分离培养的细菌，并同时完成抗菌药物的敏感性试验。

3、分子生物学诊断PCR技术直接扩增病原体基因的保守序列，配合DNA探针杂交、DNA序列分析、基因芯片（gene chip）技术等，检测临床标本中或分离培养物中细菌的核酸，可以对感染的细菌作出明确的诊断、分类、基因分型和直接检测耐药基因等，菌落原位杂交也常用于快速筛选阳性克隆。

特别是分子生物学检测技术操作的自动化分析仪，如自动化DNA提取仪，定量PCR仪，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪等，使得病原体的分子生物学诊断有可能在临床常规应用。

⑴细菌的快速鉴定：几乎所有致病菌的基因都可直接从标本中进行扩增后检测而不受非致病菌的影响，尤其是对分离培养比较困难的细菌（如结核分枝杆菌）更具特殊意义。

目前已用于结核分枝杆菌、沙门菌、志贺菌、空肠弯曲菌、致病性大肠埃希菌等致病菌的快速鉴定。

鉴定各种需氧菌和厌氧菌至种的水平，如鉴别金黄色葡萄球
菌、中间葡萄球菌及家畜葡萄球菌，鉴别铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌及荧光假单胞菌，鉴别艰难梭菌、双酶梭菌及索氏梭菌。

⑵细菌的分类鉴定：通过对两菌株DNA杂交百分率判断其同源性，若＞70%为高度同源性，基因组差别很小；如果两菌株DNA杂交百分率＜25%为非同源性，两者不相关。

⑶细菌毒素的检测：细菌的特异性毒素基因序列决定所产生毒素的种类，可用PCR扩增特异的毒素基因片段或直接用其特异性毒素基因探针检测致病菌的毒素基因，如霍乱肠毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素、艰难梭菌毒素等。

⑷细菌耐药性检测：通过扩增细菌的耐药基因或直接用耐药基因的探针检测标本中或纯培养细菌有无耐药基因，可以及早了解细菌对某些抗菌药物的耐药性或进行耐药性研究，如耐甲氧苯青霉素葡萄球菌的mecA基因、耐β-内酰胺抗生素的TEM型β-内酰胺酶基因。

⑸流行病学调查：通过分析流行菌株基因的同源性，可作为流行病学或医院感染流行菌株调查的依据。

㈡病毒感染检查
1、病毒的形态观察：光学显微镜下只能观察到大型病毒（如痘病病毒）和病毒感染后人体细胞胞质或胞核内出现的包涵体，根据包涵体的特点，如巨细胞病毒感染后可在上皮细胞的核内周围绕有一轮晕似“猫头鹰眼”样的嗜酸性包涵体；电子显微镜可直接观察到临床标本或培养物中有特征性的病毒颗粒，如轮状病毒、疱疹病毒、冠状病毒等。

2、病毒培养：由于病毒（virus）是专性细胞寄生，需要在活细胞或动物体内才能分离培养，一般通过活组织培养、鸡胚接种和动物接种，最敏感而特异的方法为鸡胚接种。

根据培养过程或动物接种后的变化特征、流行病学资料和标本来源可进行初步鉴定，有助于确定病毒的种类，但常需结合血清学试验鉴定。

病毒的分离培养与鉴定比细菌更为复杂，一般实验室较少开展。

3、病毒抗原检测：用免疫荧光或免疫酶等技术检测标本中的特异性病毒抗原，如血清中的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等。

4、分子生物学诊断⑴病毒感染的诊断及疗效观察：检测病毒核酸的序列或特异基因可确定存在病毒核酸，但是否为有感染性的病毒颗粒则有待进一步确认。

应用PCR和分子杂交技术可以直接扩增和分析DNA病毒的特异性片段；RNA病毒则应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，先逆转录为cDNA再行PCR扩增后检测；定量PCR可对标本中的病毒进行量化分析，对病毒感染的诊断和治疗观察有重要意义。

例如，患者血清中检测到乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）是诊断HBV感染最重要的依据。

HBV感染后在检测到HBV表面抗原（HBsAg）的前2~4周即可查出HBV-DNA，故可诊断HBsAg 阴性的HBV感染；通过定量PCR测定血清中HBV的载量（最低检出量可达20拷贝/ml），可以观察抗病毒疗效；急性乙型肝炎时，HBV-DNA先阳性，治愈后消失；慢性乙型肝炎时，HBV-DNA常持续存在，病毒载量或高或低。

⑵病毒的基因分型：不同病毒的DNA或RNA均有其特异的序列，同一种病毒的核苷酸组成具有一定的同源性，由此可以对病毒进行基因分型。

例如：戊型肝炎病毒（HEV）为一种RNA病毒，在全世界发现的病毒株有7个主要基因型，各型之间的核苷酸同源性为74%~76%。

⑶流行病学调查：检测感染病毒的基因型在不同国家或地区的分布特点，有助于分析流行毒株的变化特征。

例如，不同地区的HEV基因变异较大，但同一地区的HEV基因序列则相对保守，这对HEV的诊断、研制疫苗、预防感染、临床治疗有重要价值。

㈢其他病原体感染的检查
1、真菌感染的检查
真菌（fungus）为真核细胞微生物，按形态可分为单细胞和多细胞两大类。

单细胞真菌对人体有致病性的主要有新生隐球菌和白念珠菌。

多细胞真菌有菌丝（hypha）和孢子(spore)，菌丝伸长分支并交织成团，又称霉菌。

浅部真菌，如皮肤癣菌感染，直接涂片显微镜检查可见菌丝及孢子，可简便、快捷地作出初步诊断。

真菌的培养要求低、在普通培养基（如沙氏培养基）上能生长，但真菌繁殖一代时间
较长，分离培养至少需要4周。

根据真菌培养的菌落形态、菌丝和孢子、染色特点、生化反应可以进行鉴定。

真菌的抗原检测可检查血清和脑脊液中隐球菌、念珠菌及假膜组织胞浆菌感染。

分子生物学诊断在真菌感染的检查中应用较少，PCR与基因探针技术联合用于卡氏肺孢子菌感染的诊断有一定意义。

2、寄生虫感染的检查
检查出寄生虫病原体是确诊寄生虫感染性疾病的最直接依据。

根据不同种类的寄生虫感染人体后的不同发育阶段和寄生部位，采集相应的标本，如血液、粪便、阴道分泌物、骨髓等，涂片检查虫卵、虫体、包囊等是目前最可靠的确诊方法。

例如，血涂片检查疟原虫，粪便涂片检查各种蠕虫卵、肠道原虫的滋养体和胞囊，阴道分泌物涂片检查阴道毛滴虫滋养体。

部分较大的虫体，如蛔虫、绦虫节片等肉眼可以识别。

分离培养极少用，在阿米巴或弓形体感染时有一定意义。

3、螺旋体感染的检查
螺旋体（spirochete）是一类细长、柔软、弯曲呈螺旋状、运动活泼的原核细胞型微生物。

临床标本涂片在暗视野显微镜下观察到螺旋体的特殊形态和运动状态。

例如，怀疑为梅毒患者的生殖器分泌物涂片，若暗视野显微镜下观察到有胞体细长、运动活泼、由8～14个密螺旋组成的螺旋体时，有助于梅毒的诊断。

除钩端螺旋体外，其他螺旋不易分离培养，使鉴定较为困难。

分子生物学诊断螺旋体感染有一定意义，用PCR扩增可检出10条以上的钩端螺旋体。

4、支原体感染的检查
支原体（mycoplasma）是一类缺乏细胞壁、高度多形性的最小原核细胞型微生物。

革兰染色时支原体不易着色，直接涂片检查无临床诊断意义，一般以分离培养进行鉴定。

肺炎支原体和解脲脲原体分离培养需10d以上才能长出菌落，有时需20d或更长，不适合临床快速诊断。

PCR结合核酸杂交试验与序列分析，可以敏感、快速诊断各类支原体感染。

5、衣原体感染的检查
衣原体（chlamydia）是一类专性细胞内寄生的原核细胞型微生
物，主要包括沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体。

涂片检查可在被感染细胞的细胞质内查到包涵体，具有一定的诊断价值。

免疫荧光染色检查被感染细胞内的衣原体抗原，可以快速诊断衣原体感染和分型。

6、立克次体感染的检查
立克次体（rickettsia）是一类微小的杆状或球杆状的、除极少数外仅在宿主细胞内繁殖的微生物。

免疫荧光染色可检查被感染组织标本中的立克次体抗原，PCR扩增产物分析可以敏感、早期诊断立克次体感染。

常见感染性疾病的病原体检查
感染性疾病是临床的常见病，重症感染有较高的病死率。

正确的标本采集、分离培养与鉴定，及时、快速、准确地检出病原体，对感染的早期诊断和治疗等有重要的临床意义。

㈠血液与循环系统感染的检查
1、适应症
原发性血液及循环系统病原体感染较少，临床上多继发于其他疾病而致菌血症或脓毒血症、细菌性心内膜炎、心包炎、化脓性骨髓炎等。

当遇患者有下列临床表现、疾病或做有关治疗时应考虑作血液或骨髓液的病原体检查。

⑴血液与循环系统感染的症状：不明原因的发热、皮疹、肝脾肿大、关节痛、神志昏迷、休克等。

⑵血液与循环系统感染性疾病：细菌性心内膜炎、化脓性骨髓炎等。

⑶易导致血液与循环系统感染的疾病：急慢性白血病、再生障碍性贫血、粒细胞减少症或缺乏症、淋巴瘤、骨髓瘤等血液系统病，化脓性疾病、粘膜损伤性疾病、肝脏疾病继发感染、糖尿病继发感染、艾滋病、呼吸道感染及呼吸衰竭等。

⑷长期输液或导管介入治疗的疾病、血液透析、骨髓移植等。

2、标本采集
⑴在病人使用抗菌药物之前, 发热初期或高峰时或发热前半小时采血。

对已经使用抗菌药物治疗而又不能停药的患者，为了分离出病原
菌应该重复采血数次。

⑵病人在24小时内，应从不同部位采血3次。

急性细菌性心内膜炎病人, 每次采血间隔1~2h以上，亚急性细菌性心内膜炎病人, 每次间隔≥15min。

⑶采血部位为肘静脉。

疑为细菌性心内膜炎时，可从肘动脉或股动脉采血。

⑷采血部位的局部皮肤应严格消毒，避免皮肤正常菌群污染。

⑸血液注入培养瓶之前，应注意消毒培养瓶盖。

⑹将血液注入培养瓶后应轻轻摇动，使其与液体培养基混合，避免出现血凝块。

⑺成人每次采血为8~10ml，婴幼儿为1~3ml。

⑻血液培养基的选择：①实验室自制的血培养基。

②商品化培养基有需氧菌、厌氧菌、真菌和儿童血培养瓶，还有双相培养瓶（培养瓶内含有液体和固体两种培养基）等血培养系统。

为提高培养阳性率最好同时作需氧菌和厌氧菌双瓶血培养。

③怀疑L型细菌感染时，选用高渗血培养基。

⑼采血后应尽快送检，否则暂放室温。

3、常见感染病原体的检查
⑴增菌培养：①自动化血培养系统：以Bactec 9000培养系统为例，每间隔10分钟自动检测1次血培养瓶，有细菌生长则自动报告阳性。

血瓶培养5~7d时，若无细菌生长，则自动报告阴性。

对特殊细菌或真菌可延长培养时间。

自动化血培养系统具有快速检出和提高血培养阳性率等优点，检出时间的快慢取决于血瓶中细菌的种类和细菌的数量，最快阳性检出时间为1.5h，48小时阳性检出率为80%~90%。

②目测法：每日用肉眼观察培养瓶有无细菌生长迹象，并定期转种培养基。

若血培养基中有菌生长，则进一步作分离培养、鉴定或抗菌药物敏感试验。

⑵分离培养与鉴定
①需氧菌／兼性厌氧菌：需氧菌血培养瓶有细菌生长时，以无菌方法用注射器抽取培养液。

培养液直接涂片、革兰染色镜检，根据菌
体的染色和形态特点，可以初步报告结果。

将培养液转种血平板和选择培养基上，空气中35℃培养。

用常规方法或自动化细菌鉴定系统鉴定细菌，必要时用血清学试验鉴定细菌。

②厌氧菌：厌氧菌培养瓶有细菌生长时，转种培养液在厌氧菌培养基上，在无氧环境中35℃培养48～72h。

同时也将培养液转种在血平板上，置空气中35℃培养。

根据菌落生长特点、革兰染色、菌体形态、耐氧试验和生化反应鉴定厌氧菌。

临床常见厌氧菌有类杆菌群细菌如脆弱类杆菌、艾格斯类杆菌等。

③真菌：培养瓶有真菌生长时，直接用培养液涂片镜检，高倍镜下见到圆形、椭圆形芽生孢子或假菌丝体，可初步报告有酵母样真菌生长。

同时转种于沙氏培养基培养，白念珠菌生长比较快，在培养基上有乳白色或奶油色菌落生长，根据镜下形态，芽管形成试验和生化试验鉴定。

常见菌为白念珠菌。

4、其它感染病原体的检查
⑴疟原虫（Plasmodium）：用末稍血制薄血片或厚血片，进行瑞氏染色镜检，在红细胞内可找到环状体、滋养体或排列不规则的裂殖体。

⑵杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani）：肝、脾、骨髓穿刺液涂片、血涂片瑞氏染色镜检，可见到在巨噬细胞内或散在分布的圆形或卵圆形的无鞭毛虫体（又称LD小体）。

⑶微丝蚴（Microfilaria）：一般在夜间采血，可采用试管浓集法或制厚血片姬姆萨染色镜检。

新鲜血涂片中可见到似蚯蚓样活动的微丝蚴，马来微丝蚴有尾核，斑氏微丝蚴无尾核。

⑷回归热螺旋体（Borrelia recurrentis）：制薄血片或厚血片，姬姆萨或瑞氏染色镜检，红细胞空隙间见到疏螺旋体，或用1滴新鲜外周血在暗视野显微镜下见到活动的螺旋体。

5、临床意义
⑴菌血症与脓毒血症
健康人血液与骨髓液中无细菌、病毒、寄生虫等病原体，当少量细菌侵入血液后，若为一过性或持续存在、不繁殖或繁殖很少，不引
起或仅引起轻微的炎症反应，称为菌血症（bacteremia）；此外，还可出现病毒血症（virumia）、真菌血症（fungemia）等。

如果病原菌及其毒素侵入血流引起全身性炎症反应并出现临床症候群，如高热、寒战、呼吸急促、神志异常等，严重者引起休克、DIC和多脏器功能衰竭等，称为脓毒血症（sepsis）或败血症（septicemia）。

血液与循环系统的感染严重危及病人的生命。

重症感染病人、外科手术和免疫功能低下病人容易发生菌血症或脓毒血症。

美国每年大约有30万~50万菌血症病人，病死率为20%~30%。

我国不同地区和不同医院的发生率不同，原发性菌血症一般在15%左右。

菌血症或脓毒血症主要由需氧菌或兼性厌氧菌感染引起，如果是由产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、及耐万古霉素的肠球菌（VRE）、产金属酶的铜绿假单胞菌等难以治疗的细菌引起的感染，病死率较高。

厌氧菌可以引起单独感染或与需氧菌同时感染。

真菌血症常发生于二重感染。

⑵常见菌血症与脓毒血症
①常见的病原体（见表3-1-1）
表3-1-1常见菌血症与脓毒血症的病原体
种类病原体
革兰阳性细菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、其他凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、甲型溶血性链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、结核分支杆菌
革兰阴性细菌大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、鮑曼不动杆菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌
厌氧菌类杆菌群细菌如脆弱类杆菌、艾格斯类杆菌，产气荚膜梭菌
真菌白念珠菌、新生隐球菌
②革兰阳性球菌血症
MRSA及凝固酶阴性葡萄球菌：引起菌血症和脓毒血症较多，约。