3 细胞工程

异种植物细胞 植物体细胞杂交
异种动物细胞 动物细胞融合 杂种细胞
植物组织培养
动物细胞培养
转基因植物
动物细胞群
细胞杂交技术
体细胞细胞核
去核卵细胞
体外受精
核移植 重组细胞 受精卵
早期胚胎 胚胎移植 克隆动物 胚胎移植 试管婴儿
器官移植技术
Plant Cell Engineering
1 植物组织培养 2 植物细胞培养和次生代谢物的生产 3 植物细胞原生质体制备与融合 4 单倍体植物的诱发与利用 5 人工种子的研制 6 植物脱病毒技术
植物细胞的脱分化：由高度分化的植物器官、 植物细胞的脱分化：由高度分化的植物器官、组 织或细胞产生愈伤组织的过程，又称去分化。 织或细胞产生愈伤组织的过程，又称去分化。 植物细胞的再分化： 植物细胞的再分化：脱分化产生的愈伤组织在培 养过程中重新分化根或芽等器官的过程。 养过程中重新分化根或芽等器官的过程。
(2)立柱培养系统Column culture system ： 立柱培养系统 将植物细胞与琼脂或褐藻酸钠混合， 将植物细胞与琼脂或褐藻酸钠混合，制成一 个个1-2cm3的细胞团块，并将它们集中于无菌 的细胞团块， 个个 立柱中。这样， 立柱中。这样，贮液罐中下滴的营养液流经 大部分细胞，亦即“滴液区”比例大大提高， 大部分细胞，亦即“滴液区”比例大大提高， 次生代谢物的合成大幅度增强，同时占地面 次生代谢物的合成大幅度增强， 积大幅度减小。 积大幅度减小。
1 Plant Tissue Culture
组织培养是在无菌和人为控制外因(营养 组织培养是在无菌和人为控制外因 营养 成分、 的条件下， 成分、光、温、湿)的条件下，培养、研 的条件下 培养、 究植物组织、器官，细胞等外植体， 究植物组织、器官，细胞等外植体，进 而从中脱分化形成愈伤组织、 而从中脱分化形成愈伤组织、再分化发 育出整体植株的技术。 育出整体植株的技术。
(1)平床培养系统 平床培养系统Flat-bed cultivation system ： 平床培养系统 由培养床、贮液罐和蠕动泵等构成。 由培养床、贮液罐和蠕动泵等构成。新鲜的 细胞被固定在床底部由聚丙烯等材料编织成 的无菌平垫上。 的无菌平垫上。无菌贮液罐被紧固在培养床 的上方，通过管道向下滴注培养液。 的上方，通过管道向下滴注培养液。培养床 上的营养液再通过蠕动泵循环送回贮液罐中。 上的营养液再通过蠕动泵循环送回贮液罐中。 本系统设备较简单， 本系统设备较简单，比悬浮培养体系能更有 效地合成次生代谢物。不过它占地面积较大， 效地合成次生代谢物。不过它占地面积较大， 累积次生代谢物较多的滴液区所占比例不高； 累积次生代谢物较多的滴液区所占比例不高； 经常还得附加提供无菌空气的设备。 经常还得附加提供无菌空气的设备。
该系统由培养罐及四根导管连通辅助设备构成， 该系统由培养罐及四根导管连通辅助设备构成， 经蒸汽灭菌后接入目的培养物， 经蒸汽灭菌后接入目的培养物，以无菌压缩空 气进行搅拌。当营养耗尽， 气进行搅拌。当营养耗尽，细胞数目不再增加 且次生代谢物达一定浓度时，收获细胞， 且次生代谢物达一定浓度时，收获细胞，提取 产物。 产物。 突出优点是结构简单，易于操作。 突出优点是结构简单，易于操作。但它的生产 效率不够高，次生代谢物累积的量也较少。 效率不够高，次生代谢物累积的量也较少。
无机营养成分： 无机营养成分：C，H，O大量元素及部分微量元素 有机营养成分 物质： ① 含N物质：包括维生素和氨基酸 碳源：2%—5% 5%的蔗糖 ② 碳源：2% 5%的蔗糖 ③ 琼脂：起支持作用 琼脂： 生长激素：生长素， ④ 生长激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素 PH值 5.0－ PH值：5.0－6.0 常用培养基有： 常用培养基有：MS ER B5 SH HE 等
2.1 单细胞培养
单细胞分离方法：机械法、 单细胞分离方法：机械法、酶解法 单细胞培养方法：平板培养、 单细胞培养方法：平板培养、看护 培养、微室培养、 培养、微室培养、条件培养等
2.2 细胞悬浮培养 细胞悬浮培养suspension cell culture
细胞悬浮培养方法
分批培养batch culture：把细胞分散在一定容 ①分批培养 ： 积的培养基中进行培养， 积的培养基中进行培养，当培养物增殖到一定 数量时进行继代培养。 数量时进行继代培养。 ②半连续培养方法Semi continuous culture ，即每隔 一定时间(如 天 收获部分培养物 收获部分培养物， 一定时间 如1-2天)收获部分培养物，再加入等 量培养基的方法； 量培养基的方法； ③连续培养方法continuous culture (open and closed) ， 即培养若干天后在连续收获细胞的同时不断补 充培养液的方法。（封闭式、开放式） 。（封闭式 充培养液的方法。（封闭式、开放式）
1.5 移栽成活阶段 Transplant
生长于人工照明玻璃瓶中的小苗，要适 生长于人工照明玻璃瓶中的小苗， 时移栽室外以利生长。 时移栽室外以利生长。此时的小苗还十 分幼嫩， 移植应在能保证适度的光、 分幼嫩， 移植应在能保证适度的光、温、 湿条件下进行。 湿条件下进行。 移栽前要在人工气候室锻炼一段时间(称 移栽前要在人工气候室锻炼一段时间 称 为炼苗) 为炼苗 。
(2) 灭菌 灭菌sterilization 外植体→自来水多次漂洗 消毒剂处理→无菌 自来水多次漂洗→消毒剂处理 外植体 自来水多次漂洗 消毒剂处理 无菌 水反复冲洗→无菌滤纸吸干 无菌滤纸吸干。 水反复冲洗 无菌滤纸吸干。 培养基（液体培养基、固体培养基） （3）培养基（液体培养基、固体培养基）medium
2
植物细胞培养和次生代谢物的生产 Plant cell culture and Secondary metabolites
目前已发现的植物天然代谢物已超过 万种， 2 万种，而且还在以每年新发现 1600 种的速度递增。然而植物生长缓慢， 种的速度递增。然而植物生长缓慢， 自然灾害频繁， 自然灾害频繁，即使是大规模人工栽 培仍然不能从根本上满足人类对经 济 植物日益增长的需求。 植物日益增长的需求。
滤 器
Solid medium(培养基中添加 培养基中添加0.8-1.0%琼脂 琼脂): 培养基中添加 琼脂 优点：简便易行、占地面积小、可多层培养。 优点：简便易行、占地面积小、可多层培养。外植体 表面除菌后，切成小片(段 插入或贴放在培养基上即 表面除菌后，切成小片 段)插入或贴放在培养基上即 可。 缺点：外植体营养吸收不均、 缺点：外植体营养吸收不均、气体及有害物质排换不 愈伤组织易出现极化现象。 畅，愈伤组织易出现极化现象。
关键词：外植体、脱分化、再分化、 关键词：外植体、脱分化、再分化、愈伤组织
思考题 1、基本概念 、 外植体、愈伤组织、脱分化、 外植体、愈伤组织、脱分化、再分化 2、简答题 、 （1）试述组织培养的一般过程 ） （2）组织培养的灭菌方法有那些？ ）组织培养的灭菌方法有那些？ （3）试述单细胞培养过程？ ）试述单细胞培养过程？ （4）工业化细胞培养方法有那些？ ）工业化细胞培养方法有那些？ （5）试述原生质体的培养过程 ） （6）试述原生质体的杂交过程 ） （7）试述人工种子的生产过程 ）
1.3 微体快繁micropropagation
愈伤组织长出后经过 4—6 周的迅速细胞分 裂，原有培养基中的水分及营养成分多已耗 细胞的有害代谢物已在培养基中积累， 失，细胞的有害代谢物已在培养基中积累， 因此必须进行移植，即继代增殖。 因此必须进行移植，即继代增殖。
1.4生根发芽阶段 生根发芽阶段 胚状体
Liquid medium： ： 优点： 优点：营养吸收及物质交换便捷 缺点：需提供振荡器等设备，投资较大， 缺点：需提供振荡器等设备，投资较大，且一旦染菌 则难以挽回。 则难以挽回。
1.2 去分化阶段 stage of inducing dedifferentiation 愈伤组织：离体的植物器官、组织或细胞， 愈伤组织：离体的植物器官、组织或细胞，在培养一段 时间以后，通过细胞分裂，形成一种高度液泡化、 时间以后，通过细胞分裂，形成一种高度液泡化、无定 形状态薄壁细胞组成的排列疏松无规则的组织。 形状态薄壁细胞组成的排列疏松无规则的组织。
cell engineering
在细胞水平上研究、开发、利用各类细胞的工程， 在细胞水平上研究、开发、利用各类细胞的工程， 亦即人们根据科学设计改变细胞的遗传基础， 亦即人们根据科学设计改变细胞的遗传基础，并通过 无菌操作，大量培养细胞、组织乃至完整个体的技术。 无菌操作，大量培养细胞、组织乃至完整个体的技术。 细胞培养 细胞融合 细胞悬浮培养及次生代谢机理 单倍体诱发与利用 人工种子生产 植物脱毒技术
植物组织培养程序
离体的植物 脱分化 器官、组织、 器官、组织、 细胞 愈 伤 再分化 组 织 根 植 物 体
芽
1.1 准备阶段 一般分成五个阶段 1.2 去分化阶段 1.3 微体快繁 1.4生根发芽阶段 生根发芽阶段 1.5 移栽成活阶段
1.1 准备阶段Preparatory
phase
选择合适的外植体Selection of suitable explants (1) 选择合适的外植体 ①Appropriate size ：外植体的组织块要达到 万个细胞( 10mg)以上才容易活 以上才容易活。 2 万个细胞(即 5-10mg)以上才容易活。 ②Suitable site：同一植物不同部位的外植体的 ： 分化能力、分化条件及分化类型有相当大差别。 分化能力、分化条件及分化类型有相当大差别。 ④Appropriate species：不同物种相同部位的 ： 外植细胞分化能力可能大不一样。 外植细胞分化能力可能大不一样。
压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广。 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广。 电热干燥箱：干热消毒（160℃ 小时） 电热干燥箱：干热消毒（160℃ ，2小时）。主要 用于玻璃器皿消毒 。 滤器： 过滤除菌： 大多数培养用液， 滤器 ： 过滤除菌 ： 大多数培养用液 ， 如人工合成 培养基、血清、酶液等均采用过滤法除菌 。 培养基、血清、 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境。 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境。 紫外灯：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、 紫外灯：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操 作台、 作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒 。
Formation of bud and root
在组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似 合子胚的构造。 合子胚的构造。 通常要将愈伤组织移置于含适量细胞分裂素，没 通常要将愈伤组织移置于含适量细胞分裂素， 有或仅有少量生长素的分化培养基中， 有或仅有少量生长素的分化培养基中，才能诱导 胚状体的生成。光照是本阶段的必备外因。 胚状体的生成。光照是本阶段的必备外因。根据 实验工作的需要， 实验工作的需要，有时也可不经愈伤组织阶段而 直接诱导外植体分生、 直接诱导外植体分生、 分化长成一定数量的丛生 然后再诱导其生成根。 芽，然后再诱导其生成根。
应用的原理和方法 概 念 细 胞 工 程 研究的水平 研究的目的
细胞生物学和分 子生物学
细胞整体水平或细胞器水平 按照人们的意愿来改变细 胞内的遗传物质或获得细 胞产品
植物细胞工程 分 类
理论基础
细胞的全能性
动物细胞工程
主 要 技 术
植物 细胞 工程 技术 动物 细胞 工程 技术
植物体细胞杂交 植物组织培养 动物细胞培养 动物细胞融合 单克隆抗体技术 核移植 胚胎移植
2.3 固定化细胞培养 Immobilization cul源自文库ure of plant cells
细胞固定化后的密集而缓慢的生长有利于细胞的 分化和组织化，从而有利于次生代谢物的合成。 分化和组织化，从而有利于次生代谢物的合成。 此外， 此外，细胞固定化后不仅便于对环境因子的参数 进行调控，而且有利于在细胞团间形成各种化学 进行调控， 物质和物理因素的梯度， 物质和物理因素的梯度，这是调控高产次生代谢 物的关键。 物的关键。 细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或 贴附在它的表面。 包埋法（凝胶、纤维、微胶 贴附在它的表面。 包埋法（凝胶、纤维、 ），吸附法 玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、 吸附法（ 囊），吸附法（玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、 中空纤维） 中空纤维）