硅胶柱层析技术

柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小 （反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。 试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知， 恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那 么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比 较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么 了（有些不环保的说， 不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。
7、检测
要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外 的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。
8、送谱
收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体， 可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm 左右所谓的“硅胶”峰。
TIPS:
1.先根据TLC方法筛选好洗脱剂，使两相邻物质Rf值之差最大化 2.将柱子必须装平整、均匀 3.考虑有限柱填料的吸附量 4.可考虑用梯度法分开并洗脱
柱层析
1、吸附色谱的原理 在一定条件下，硅胶与被分离物质之间产生作用，这种作用主要是 物理和化学作用两种。物理作用来自于硅胶表表面与溶质分子之间的 范德华力；化学作用主要是硅胶表面的硅羟基与待分离物质之间的氢 键作用。
2、操作步骤 2.1 硅胶准备
硅胶一般选用250-400目(即40-63μm直径的硅胶颗粒)，根据ΔRf 选用硅胶的用量。 2.2 实验仪器准备 一支玻璃色谱柱,一个铁架台,烧杯,锥形瓶,径口直径较大的玻璃漏斗, 一支玻璃棒, 等。
②加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗 剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼 缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可 过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
③常压柱色谱，又称柱层析，是色谱法中最常见的一种。它的突出优点 是，分离效率比经典的化学分离方法高的多，与其他色谱法相比，不 需要昂贵的仪器设备，更换流动相和吸附剂方便，消耗材料少，成本 低，适合分离取样量从克到微克级范围很宽的各种样品，因此在化学 实验室中至今仍被广泛应用。
5、上样
干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将 一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂， 而不会冲坏硅胶表面。
6、过柱和收集
柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好， 推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收 一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300目酸乙酯：石油醚系统 极性较大的用甲醇：氯仿系统 极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统 拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸
匀浆法
1、称量
200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍 量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯 量100ml也可以。
②湿法：将吸附剂与流动相混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱管 中，然后再加入流动相，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面 平整。 俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下，液面将与柱表 面相平时，即加试样溶液。
2.3.2试样的加入
①将试样溶于层析时使用的流动相中，再沿色谱管壁缓缓加入。注意勿 使吸附剂翻起。
2.5.2 正式检测
①点样: 取分部收集的冲洗溶液进行分别直接点样,如果冲洗溶液太稀,浓 度太小,可先浓缩.点样的容器一般用玻璃毛细管,点样斑点的直径一般 为3-5mm.
②展开:在普通的展开槽中进行,展开方式常选用上行展开.
③展开剂:使用冲洗溶液.
④显色:一般常用物理检测法和化学检测法.物理检测法中首先有紫外光 法,紫外光常用两种波长(254nm与365nm).其次是碘蒸气显色法.化 学检出法通常惊醒显色剂直接喷雾.显色剂有通用显色剂和专用显色 剂.通用显色剂最常见的是硫酸-乙醇或甲醇(1:1)溶液,喷雾后,有的化 合物立即反应,但多数化合物需加热后经历数分钟才显色,不同化合物 的反应不同,所以颜色也往往不同.专用显色剂是指对某个或某一类化 合物显色的试剂,利用化合物本身的特有性质,或利用其所含的某些官 能团的特殊反应.展开后根据斑点的,可以粗略的估计待分离物的含量 的大小.
3、色谱柱的选择
柱子可以分为：加压，常压，减压。
压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减 低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的， 但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
①减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由 于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结）， 以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽 气（很大的噪音，而且时间长）。
4.2 展开
4.2.1展开剂选择
选择展开剂时,可采用微量圆环法和小型色谱法进行选择.
①微量圆环法:将欲分离的物质,按常规方法点在薄板,两点相距2-3cm,再 用毛细管吸取所实验的溶剂系统,垂直放于样点中心,让溶剂自毛细管 中依中立流出进行展开,干燥后显色.观察斑点的分离情况.背试物质为 未知化和物时,常先用低极性溶剂展开,如式样留在圆点不动,则需增加 溶剂的极性或增大洗脱液的量,如移动过快,则必须用较低极性的溶剂 来调整.
2.3 装柱
2.3.1 吸附剂的加入
①干法：将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管 壁缓缓加入开始层析时使用的流动相，或将色谱管下端出口加活塞， 加入适量的流动相，旋开活塞使流动相缓缓滴出，然后自管顶缓缓加 入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操 作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。
其实硅胶柱层析技术也可以 称作硅胶吸附柱色谱技术
色谱法，又称层析法。是一种以分配平衡为机理 的分配方法。色谱体系包含两个相，一个是固定 相，一个是流动相。当两相相对运动时，反复多 次的利用混合物中所含各组分分配平衡性质的差 异，最后达到彼此分离的目的。
色谱法按固定相的状态可分为柱色谱、平板色谱 和棒色谱三种，而实验室中最常用的是柱层析和 薄层层析，以及它们之间的配合应用。
可是有的上样后在硅胶上又会析出这一般都是比较大量的样品才会出现是因为硅胶对样品的吸附饱和而样品本身又是比较好的固体才会发生这就应该先重结晶得到大部分的产品后再柱分如果不能重结晶那就不管它了直接过就是了样品随着淋洗剂流动会溶解的
硅胶柱层析技术
常说的过柱子应该叫柱层析 分离，也叫柱色谱。我们常用的是 以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
柱子可以分为：加压，常压，减压。
压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低 柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但 是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由 于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结）， 以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽 气（很大的噪音，而且时间长）。
4.3 显色
展开后,如物质有色,可明显的在薄层上观察到它们的位置.如无色,则 要通过一定的方法显色,定位,一边确定斑点的位置及大小.
4.4 常用溶剂的极性
常用溶剂的极性顺序：石油醚〈环己烷/己烷〈苯〈乙醚〈氯仿〈乙 酸乙酯〈正丁醇〈丙酮〈乙醇〈甲醇〈水。
在薄层色谱中,当溶剂的极性太大时.会使待分离物全部接近溶剂 前沿,当溶剂的极性太小时,又会使待分离物几乎全部保留在圆点,这两 种情况都是待分离物得不到分离.
②或将试样溶于适当的溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽 后使呈松散状；将混有试样的吸附剂加在已制备好的色谱柱上面。如 试样在常用溶剂中不溶解，可将试样与适量的吸附剂在乳钵中研磨混 匀后加入。
2.4洗脱 除另有规定外，通常按流动相洗脱能力大小，递增变换流动相的品 种和比例，分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不 再含有时，再改变流动相的品种和比例。操作过程中应保持有充分的 流动相留在吸附层的上面。
3、装柱
将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿）， 装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降， 会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。
4、压实
沉降完成后，加入更多的石油醚（氯仿） ，用双联球或气泵加压， 直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱， 都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床 萎缩产生开裂。
4 溶剂的选择
溶剂的选择也许是整个柱色谱分离操作中最困难之处,也是实验成功 的最关键之处.溶剂通常先利用简便的硅胶薄层色谱进行筛选.
4.1 薄层色谱点样
把样品溶解在一种低沸点的有机溶剂中(如氯仿,丙酮.甲醇.乙醇等)然 后用毛细管或微量点样管将试液点到薄层板上.点样量要适当,一般点 样量少些,则分离叫清晰.但要注意到检测灵敏度.
③ 双向展开法:取方形薄板像纸色谱一样进行双向展开.
④ 径向展开法:可将吸附剂涂成圆形或扇形,在圆心部分加如展开 剂,使薄层径向展开.
⑤ 多次展开:用展开剂对薄层展开一次.称为单次展开.一次展开 后,取出薄板,挥发出去展开剂后再行展开.
⑥ 梯度展开:该法所用的展开剂在连续不断的改变组成.一般可把 一个装有强极性展开剂的滴定管深入密闭的含弱极性的展开剂的层析 槽中,槽中用电磁搅拌器把滴下的强极性展开剂混匀,此时,展开剂的极 性逐渐由弱变强,使极性差别较大的多种组分混合物得以很好的分离.
2、搅成匀浆
加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚 /乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就 用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸 乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸 钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对 酸敏感，不能用氯仿体系过柱。
加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗 剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼 缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可 过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品。
关于柱子的尺寸
2.6 合并
根据上面薄层检测的结果,我们可以将具有相同Rf值的部分进行合并, 然后利用旋转蒸发器对合并部分进行旋转蒸发,最后得到我们需要的 目标产物.
2.7色谱柱的洗涤
在绝大多数情况下,硅胶分离柱中的硅胶是一次性使用,但在使用后的 色谱柱中由于还含有冲洗溶剂,所以要将里面的硅胶到出是比较困难 的.取出硅胶的一种方法是将该柱放置一段时间,让溶剂自然挥发完后, 倒出硅胶.但这种方法既费时又污染环境.第二种方法可以用一根比色 谱柱稍长的木杆或塑料杆将含有溶剂的硅胶一段一段地掏出,但这种 办法也比较麻烦.第三种方法时利用一个一般地真空泵, 将柱中剩余的 溶剂进行减压抽出,在色谱柱和真空泵之间加一个冷阱,这样抽出地溶 剂既进行了有效地收集而不污染环境,而色谱柱中地硅胶又能较快得 到干燥,使硅胶能够方便地倒出.
使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合 溶剂通常使用一个高极性和低极性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶 剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有：Petroleum ether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/Ether, Petroleum ether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ ethyl acetate
2.5 检测 2.5.1 初步检测
当冲洗溶剂流出一定量后，可对流出液进行初步检测，并且将锥形 瓶更换成小试管进行收集。一般只进行初步的快捷检测，因此通常是 取一小薄层板，用铅笔和直尺将硅胶板分划成多个小方块，并按一定 的次序编号。取一根内径为0.3mm左右的玻璃毛细管蘸取少量流出 液，点于薄层板的一个小格内，待半点干后，然后用物理的或化学的 方法检测。
②小型色谱法.用普通的载薄片制成薄板,把欲分离的物质点载薄板上,放 于小型玻璃缸或广口瓶中展开,干燥后显色,观察斑点分离情况.
4.2.2 展开
薄层色谱的展开方法有上行法,下行法,双向展开法,径向展开法等。
① 上行法:使展开剂由下向上爬.
② 下行法:使展开剂由上向下.该法可使用极性较弱的展开剂.