细菌分类鉴定规程

细菌分类鉴定规程
细菌分类鉴定规程
杜艳、余翔、罗国升
新菌鉴定主要流程：
1、潜在新菌的确定
拿到拼接好的16Sr RNA gene序列后，进入NCBI blastN ()或EzTaxon server 2.1() 进行比较，同源性低于98%的序列(同源性处于98-97%之间的序列最好少于3株)，可初步判断存在新菌的可能。

2、选择标准菌株构建进化树
选择参考菌株构建三种进化树(NJ、MP和ML)，构建进化树是需要注意以下几点：1）所选择的序列必须都是在IJSEM上正式发表的序列，2）所选择的参考菌株必须包含新菌所在属的所有标准菌株，3）需要选择新菌所在科的一些与新种所在属相近的属的type species作为参考菌株，4）需要选择一个远源的菌株作为参考菌株，如：E. coli。

3、购买标准菌株
根据进化树位置和同源性高低选择标准菌株作为参考菌株，联系相关保藏机构购买标准菌株。

具体信息可以在上查找。

标准菌株的选择需遵循以下几点：1) 如果要用到不同的属但不是用这些属的所有的种，则要选择这些属的模式种，并且要选择模式种的模式菌株。

2) 一个属的模式种是最重要的参照微生物，如果一个新种被认为属于这个属，就一定要与该属的模式种进行比较，而其他的种可能分类时出现错误，可能将来会被重
新分类。

总之，进行种、属、甚至是科的比较研究时，都要用模式微生物，这就涉及到模式属的模式种，模式种的模式菌。

4、表型特征实验
培养特征：菌落特征(如菌落的形状、大小、颜色、隆起、表面状况、质地、光泽、水溶性色素等)。

细胞形态：形态(球形、杆状、弧形、螺旋形、丝状、分枝及特殊形状)，大小，排列(单个、成对、成链或其他特殊排列方式)。

特殊的细胞结构：鞭毛(着生位置、数量)，芽胞(形状、着生位置、是否膨大)，孢子(孢子形状、着生位置、数量、排列)，其它 (荚膜、细胞附属物为柄、丝状物、鞘、蓝细菌的异形胞、静止细胞和连鞘体等)。

超微结构：细胞壁、细胞内膜系统、放线菌抱子表面特征等。

细胞内含物：异染颗粒、聚β-羟基丁酸等类脂颗粒、硫粒、气泡、伴胞晶体等。

染色反应：革兰氏染色、抗酸性染色。

运动性：鞭毛泳动、滑行、螺旋体运动方式，注意区别鞭毛泳动和滑动。

生长特征：生长温度、pH、盐耐受性范围。

5、生理生化试验
营养类型：光能自养、光能异养、化能自养、化能异养及兼性营养型；
对氮源的利用能力：对蛋白质、蛋白胨、氨基酸、含氮无机盐、N2等的利用；
对碳源的利用能力：对各种单糖、双糖、多糖以及醇类、有机酸等的利用；
对生长因子的需要：对特殊维生素、氨基酸等的依赖性；
需氧性：好氧、微好氧、厌氧、兼性厌氧；
对温度及pH的适应性：最适、最低及最高生长温度及致死温度；
对渗透压的适应性：对盐浓度的耐受性或嗜盐性；
对抗生素及抑菌剂的敏感性：对抗生素、氰化钾(钠)、胆汁、弧菌抑制剂或某些染料的敏感性；
代谢产物：各种特征性代谢产物；
与宿主的关系：共生、寄生、致病性等。

6、化学分类特征
目前经常使用的特异性细胞化学特性包括：细胞壁化学组分、枝菌酸、脂肪酸、磷酸类脂、甲基萘醌、全细胞蛋白及核糖体蛋白电泳分析等。

其分析技术涉及光谱、色谱、生物化学及分子遗传学的分析技术。

常用的化学分类指标
1) 细胞壁组分分析：
细胞壁氨基酸组分可用于属的区分，而糖组分则可用于种的区分。

2) 脂肪酸组分分析
脂类是细胞膜的主要组分。

在原核生物中，细菌具有酰基脂(酯键连接)，最常见的是磷脂和甘油脂。

在某些放线菌和棒杆菌中有特异的磷脂，即磷脂酸肌醇甘露糖苷。

鞘磷脂则发现于某些革兰氏阴性菌，如拟杆菌。

古菌具有醚脂(醚键连接)。

某些特殊组分只在特定的细菌中存在，如多不饱和脂肪酸是蓝细菌的特征组分，甲基化的分枝脂肪酸为革兰氏阳性菌所特有，羟基化脂肪酸为革兰氏阴性菌的特征。

3) 异戊二烯醌型分析
三大类即泛醌(Q)、甲基萘醌(MK)和酰甲基萘醌，类异戊二烯的数目和侧链的双氢键表明了醌的种类。

异戊二烯醌的分析方法有两种，色谱法和物理化学法。

分类意义主要在于某类组分的有无。

多数严格好氧的革兰氏阴性菌仅产泛醌，兼
性厌氧的革兰氏阴性菌则不定，而多数好氧和兼性厌氧的革兰氏阳性菌仅产甲基萘醌。

7、基因型特征
1) 16S rRNA同源性分析
原核生物的rRNA分为3种，分别为5S rRNA (约120bp)、16S rRNA (约1540bp)、23S rRNA (约2900bp)，位于同一操纵子中。

对16S rRNA基因序列的分析，适用于确定属及属以上分类单位的亲缘关系；而对23S rRNA基因序列的分析，则适合对临床常见致病微生物鉴别诊断；16S～23S rRNA基因序列(ITS)被认为是细菌分型探针合成的合适部位，所以更适合种内菌株间的鉴别。

大量证据表明，两个菌株16S rRNA基因序列相似性＜97%则不是同一个种。

单靠16S rRNA基因序列是不能描绘一个新种的，但是它是分离出新种的首要标志。

两个菌株16S rRNA基因序列相似性＞97%，则要用DNA-DNA杂交或更高分辨率的基因序列分析等方法进行进一步的研究。

16S rRNA基因序
列相似性＜ 95%，则要结合其他方法以便确定是否为新属。

如果是新种，作者要指出新种与其所属的属中的其他种的不同点。

如果这个属包含很多不同的种，则要科学的选择一部分进行比较，但必须是模式种。

如果是新属，则要区分新属和其相近的属。

近年来发表的文章中属的描述没有和已存在的属进行区分，违反了分类学的基本原则。

这些界限在实践中不一定准确，化学分类的数据也是关键，还要结合其他方面的鉴定，不能单凭16SrRNA基因序列下结论。

2) G+C mol%测定
每一个微生物种的 DNA中G+C mol%的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化而变化，而且在同一个属不同种之间，DNA中
G+C mol%的数值不会差异太大，可以某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种的 G+C mol% 范围。

DNA中G+C mol% 分析主要用于区分细菌的属和种，因为细菌 DNA中G+C mol%含量的变化范围一般在 25％～75％；而放线菌DNA中的G+C比例范围非常窄(37％～51%)。

通常认为，种内菌株间相差不超过4%，属间菌株间相差不超过10%，相差低于2%没有分类学意义。

因此可利用G+C mol％来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度。

值得注意的是，亲缘关系相近的菌，其G+C mol％含量相同或者近似，但G+C mol％相同或近似的细菌，其亲缘关系并不一定相似，这是因为这一数据还不能反映出碱基对的排列序列，而且如放线菌的DNA的G+C mol% 在37～51之间，企图在这么小的范围内区分放线菌的几十个属显然是不现实的。

要比较两种细菌的DNA碱基对排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸杂交试验。

3) DNA-DNA杂交
DNA杂交法的基本原理是用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对结合成双链DNA，然后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。

如果两条单链 DNA的碱基顺序全部相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率为100% 。

如果两条单链DNA的碱基序列只有部分相同，则它们能生成的“双链”仅含有局部单链，其杂合率小于 100% 。

由此；杂合率越高，表示两个DNA之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。

如两株大肠埃希氏菌的DNA 杂合率可高达100%，而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的 DNA 杂合率较低，约有70%。

G+C mol% 的测定和 DNA 杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新
的途径，解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题，但对于许多属以上分类单元间的亲缘关系及细菌的进化问题仍不能解决。

菌株间16S rRNA基因序列相似性＞97%需要做DNA-DNA杂交，＜97% DNA-DNA杂交可做可不做。

DNA-DNA杂交同源性与其亲缘性关系的判断标准：杂交同源性为70-100%，属于同一个种的细菌；同源性20-70%，属于属内紧密相关的种；同源性小于20%，则属于相关的不同属。

目前DNA-DNA杂交的标准方法为固相膜杂交。

8、序列的提交
向NCBI提交16S rRNA gene序列。

具体步骤见资料介绍部分。

9、菌株的保藏
向至少两个不同国家的世界公认的保藏机构保藏菌株，国内选择CGMCC、CCTCC等，国外的选择KCTC、KACC、DSMZ、NRRL、JCM、ATCC等。

菌种保藏要有菌株名称，所用培养基，菌株的生长特性(最适生长温度、pH等)，16S rRNA gene序列等信息。

新菌鉴定相关资料：
一、菌种命名专家：Dr. Jean Euzeby(IJSEM List Editor，
Jean Euzéby,Laboratoire de Bactériologie, École Nationale Vétérinaire, 23 chem in des Capelles, 31076, Toulouse cedex 03, France；
Fax: + 33 (0)5 61 19 39 75; E-mail: jean.euzeby @ gmail.co m或者)。

二、菌种保藏：我们实验室保藏过菌的机构有：
1．CCTCC(China Center for Type Culture Collection) 中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。

网址：。

2. CGMCC (China General Microbiological Culture Collection Center) 中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京微生物所)。

网址。

3. KACC(Korean Agricultural Culture Collection) 韩国国家农业生物技术研究所——农业微生物菌种保藏。

网址：。

4. KCTC (Korean Collection for Type Cultures) 韩国典型培养物保藏中心。

网址：。

5. NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心。

网址：。

6.DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Ger man Collection of Microorganisms and Cell Cultures) 德国微生物菌种保藏中心。

网址：。

三、购买菌种(我们实验室已从下列机构购买过菌种)
1、CCTCC(China Center for Type Culture Collection) 中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。

网址：。

2、CGMCC (China General Microbiological Culture Collection Center) 中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京微生物所)。

网址。

3、KACC(Korean Agricultural Culture Collection) 韩国国家农业生物技术研究所——农业微生物菌种保藏。

网址：该保藏中心可以免费提供标准菌株。

4、KCTC (Korean Collection for Type Cultures) 韩国典型培养物保藏中心。

网址：是由政府科学技术部门支持的半政府性质的菌种保藏中心。

主要从事应用微生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏、发酵、分子生物学、分类学等的研究。

5、DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) 德国微生物菌种保藏中心。

网
址：DSMZ成立于1969年，是德国的国家菌种保藏中心。

该中心一直致力于
细菌、真菌、质粒、抗菌素、人体和动物细胞、植物病毒等的分类、鉴定和保藏
工作。

该中心是欧洲规模最大的生物资源中心，该中心保藏的菌种可出售。

另外，
该中心还提供菌种的分离、鉴定保藏服务。

6、CCUG (Culture Collection, University of Göteborg, Sweden) 瑞典Geborg大学
菌物保藏中心。

网址：。

7、JCM (Japan Collection of Microorganisms)日本微生物保藏中心。

网址：。

8、NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保
藏中心。

网址：。

四、化学成分测定
1、全细胞脂肪酸分析
上海市公共卫生临床中心()联系人：朱召芹联系电话：传真：-5272电子邮箱：。

2、呼吸醌分析
中国典型培养物保藏中心(武汉大学)及云南大学云南省微生物研究所 ()。

3、极性脂分析
中国典型培养物保藏中心(武汉大学)及云南大学云南省微生物研究所 ()。

4、G + C mol%
中国典型培养物保藏中心(武汉大学)及云南大学云南省微生物研究所 ()。

4、细胞壁肽聚糖及糖类分析
广东省微生物研究所()及云南大学云南省微生物研究所 ()。

5、 DNA-DNA杂交广东省微生物研究所()。

五、向G en B ank提交序列
向NCBI提交序列常用的程序有两个，一个是在线提交的BankIt，一个是用软件Sequin。

用那种办法，根据不同的需要。

BankIt:(在线提交页面：)
1、适合单个或少量几个的提交
2、喜欢用在线的方式提交，无需下载个软件
3、你的序列的注释不复杂
4、提交你的序列时不需要用到序列的分析
Sequin（下载页面：）
1、提交的是批量而且比较复杂的序列
2、
you are submitting mutation, phylogenetic, population, environmental, or segmented s ets
3、喜欢图形的界面，有更的选项和功能，可以批量修改
4、获得相关的分析工具
这里简单介绍一下在线提交序列程序BankIt，Sequin也是大同小异的。

提交网址：
进入网站，点击注册。

1、使用BankIt提交序列时需要先在NCBI上注册一个账号（改版后），获得你的账号和密码，登陆，进入GenBank Submissions页面，填写相关信息后，点击continue。

如下：
2、填写序列的作者信息和所提交序列用到的参考文献（2-3篇），点击continue。

3、上传序列（text格式文件），可以直接粘贴也可以上传text文件，点击continue。

6、填写序列名称，点击continue。

6、Submission Category
7、Source Modifiers
8、填写引物信息PCR Prime rs
9、提交，检查确认无误后就可以点击continue提交序列。

10、Review Submission 确认信息，点击提交序列。

最后NCBI会给您发个邮件，大概过一个月后就能查到您的注册号了，如果有问题NCBI会邮件和您联系。

如果是用Sequin，填好资料过程中可以随时保存，最后你只需把最后确认的文件向NCBI发封邮件就可以了。

六、分析时用的网站和软件
常用网站：
1、序列比对网站：
1) NCBI()
2) EzTaxon server 2.1.35:8080/ （推荐使用）
此网站是韩国的，需要注册，是国际承认的。

16S比对结果比NCBI上的结果好的是，它是相当于把NCBI过了筛，全部是模式菌株，而且更新很快。

可以将最近的种属关系显示出来，同源性，以及碱基差异个数等等结果。

在此网站比对时要注意序列方向的正确性，它不能自己识别正反向。

一般我们在做新菌序列比对时可以先用EzTaxon server 2.1，然后再用NCBI里的“Align two or more sequences”选项比一遍，最后综合看2个结果。

2、查找模式菌的网站LPSN：
全名叫List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature 此网站有详细的模式种，原核生物的分类关系，具体的属，科，目，纲等所包括的东西，但是它更新比较慢。

所以我们要注意多查看IJSEM上的信息。

网站，我们在此网站上的注册名是，密码是emicrobiology.
常用软件
16S 序列分析好了以后选取合适的序列构建进化树，序列选好以后首先用多序列比对工具Clustal X（本地的）或Clustal W（在线的）进行比对。

比对后，可以对其进行掐头去尾，再保留结果。

然后用MAGA软件将生成的aln格式的文件转化为mega格式，再用MEGA做进化树。

现在做进化树一般都要求有3种，NJ,MP和ML.一般我们做NJ，MP树的时候用MEGA 4.0,做ML树的时候用PhyML或者PHYLIP.下表是构建进化树是可用的软件。

表1 构建分子进化树相关的软件
基于距离的方法有UPGMA、ME（Minimum Evolution，最小进化法）和NJ（Neighbor-Joining，邻接法）等。

其他的几种方法包括MP （Maximum parsimony，最大简约法）、ML（Maximum likelihood，最大似然法）以及贝叶斯（Bayesian）推断等方法。

其中UPGMA法已经较少使用。

一般来讲，如果模型合适，ML的效果较好。

对近缘序列，有人喜欢MP,因为用的假设最少。

MP一般不用在远缘序列上，这时一般用NJ或ML.对相似度很低的序列，NJ往往出现Long-branch attraction（LBA，长枝吸引现象），有时严重干扰进化树的构建。

贝叶斯的方法则太慢。

对于各种方法构建分子进化树的准确性，一篇综述（Hall BG. Mol Biol Evol 2005，22（3）：792-802）认为贝叶斯的方法最好，其次是ML,然后是MP.其实如果序列的相似性较高，各种方法都会得到不错的结果，模型间的差别也不大。

对于NJ和ML，是需要选择模型的。

对于各种模型之间的理论上的区别，这里不作深入的探讨，可以参看Nei的书。

对于蛋白质序列以及DNA序列，两者模型的选择是不同的。

以作者的经验来说，对于蛋白质的序列，一般选择Poisson Correction（泊松修正）这一模型。

而对于核酸序列，一般选择Kimura 2-parameter（Kimura-2参数）模型。

如果对各种模型的理解并不深入，作者并不推荐初学者使用其他复杂的模型。

Bootstrap几乎是一个必须的选项。

一般Bootstrap的值>70，则认为构建的进化树较为可靠。

如果Bootstrap的值太低，则有可能进化树的拓扑结构有错误，进化树是不可靠的。

对于进化树的构建，如果对理论的了解并不深入，推荐使用缺省的参数。

需要选择模型的时候（例如用NJ或者ML建树），对于蛋白序列使用
Poisson Correction模型，对于核酸序列使用Kimura-2参数模型。

另外需要做Bootstrap检验，当Bootstrap值过低时，所构建的进化树其拓扑结构可能存在问题。

并且，一般推荐用两种不同的方法构建进化树，如果所得到的进化树类似，则结果较为可靠。