ELESA检测基础知识
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• 注意不要反复冻融。
试剂的准备
• 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的
试剂 。
• 从冰箱中取出的试剂和待检样本应待温度
与室温平衡后使用 。
加样
• 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，
加酶结合物，加底物。加样时应加在微孔 板的底部，并注意不可溅出，尽量避免产 生气泡。
• 加标本一般用微量加样器，按规定的量加
用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方 法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。
竞争法测抗体 （Anti-HBc)
竞争法测抗体
• 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不
易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测 特异性抗体。
• 其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗
体竞争与固相抗原结合 。
竞争法测抗原
• 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的
• 先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标
本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性 IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗 原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加 酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物 作用，呈色即与标本中的IgM成正相关 。
ELISA试剂盒常用组份
• 已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂） • 酶标记的抗原或抗体（结合物 ） • 酶的底物 • 阴性对照品和阳性对照品（定性检测）参考
如在抗原抗体反应后Ab*Ag中的标记物*失去其特性，例如酶 失去其活力，荧光物质不显荧光，则不需要进行Ab*Ag与 Ab*的分离，可以直接测定游离的Ab*量，从而推算出标 本中的Ag含量，这种方法称为均相法。
ELISA的原理
• ELISA的这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体 结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体， 这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留 酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的 抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与 固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方 法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物 质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中 受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物 后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标 本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应 的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率 很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方 法达到很高的敏感度。
清）、分泌（唾液）和排泄物（如尿液、粪便） 等。
• 大部分ELISA检测均以血清、血浆为标本。
• 应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧
化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中， 溶血标本可能会增加非特异性显色 。
• 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中
可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
疫分析、酶免疫技术 、化学发光免疫技术 和金标免疫和Perlmann发表了酶联免疫
吸附剂测定(ELISA）用于IgG定量测定的文 章,使得用于抗原定位的酶标抗体技术发展 成液体标本中微量物质的测定方法。
• 酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游
入板孔中 。
• 每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污
染。
温育
• 抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和
时间，这一保温过程称为温育 。
• 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和
4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用 的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的 合适温度。
•
洗涤
• ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合
离的酶标记物而分为均相（homogenous）和异相 （heterogenous）两种类型 。
• 如以标记抗体检测标本中的抗原为例，其反应式如下：
Ab*＋Ag→Ab*Ag＋Ab*
如在抗原反应后，先把Ab*Ag与Ab*分离，然后测定Ab*Ag或 Ab*中的标记物的量，从而推算出标本中的抗原量，这种 方法称为异相法。
ELISA的类型
• 双抗体夹心法测抗原（HBsAg、 HBeAg等）
双抗体夹心法测抗原
• 适用于检验各种蛋白质等大分子抗原 ，这
种双位点夹心法具有很高的特异性，而且 可以将受检标本和酶标抗体一起保温作一 步检测。
• “HOOK效应” ：在一步法测定中，当标
本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分 别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形 成"夹心复合物"如按常法测读，所得结果将 低于实际的含量 。
• BM公司（现属Roche公司）ES600型全自动EIA分析仪，
该系统可测定病毒标志物，治疗药物，激素，肿瘤标志物 等60余项目。
• 美国Johnson OCD公司的Vitros Eci全自动任选式增强化学
发光免疫分析系统，此仪器将酶免疫技术，生物素亲合素 技术和增强化学发光技术相结合。
• 美国DPC公司的IMMLITE2000型全自动任选式酶标记抗原
•技术的进步 •仪器的自动化 •临床应用
EIA的技术进步
• 抗体制备技术的进步使检测范围日益扩展，使小
分子抗原，半抗原的检测成为事实。
• 酶标记技术的进步，从过氧化物酶，扩展到碱性
磷酸酶，B半乳糖苷酶，尿毒酶，葡萄糖氧化酶， 葡萄糖6磷酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶。
• 改进固相载体的技术，由聚苯乙稀微孔（珠），
ELISA试剂质量考核指标
• 从临床应用角度考核检验试剂的可靠性，
是以其能否区分健康与疾病的能力作为依 据的。
• 目前还很难找到100%可靠的试验，任何试
验都会出现假阳性或假阴性。
• 试验的可靠性常以其灵敏度及特异性作为
考核标准。灵敏度（阳性的检测百分率） 特异性（阴性的检测百分率）
酶免疫分析技术及应用进展
• 固相载体以形式分有：微孔板、磁性微珠
和小试管。以微孔板最为常用。
酶与底物
• 凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均
可作为标记用。
• 应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比
活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法 测定。
• 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶
(HRP)和硷性磷酸酶(AP)
• 体液中微量蛋白定量 • 细胞因子，细胞间粘附因子，生长因子的定量 • 基因表达蛋白的检测 • 其他各种恒量代谢物，神经介质，激素介质，活性激素，
多能上能下胺类代谢物，及细胞内信使的定量
• 因此，凡是可取得抗体或纯品抗原者均可用EIA完成定量，
或抗体
EIA的临床应用
• 检测范围日益扩展，目前主要用于 ： • 激素及其受体的检测。 • 肿瘤标志物检测。 • 病原微生物的抗体及可溶性抗原的检测，是诊断各种病原
微生物感染的重要手段，如病毒、细菌、螺旋体、支原体、 衣原体、立克次体等，尤其是其在体液中可溶性抗原的检 出可实现早期诊断。以检测体内病原体抗原的检查代替抗 体检查已成为发展趋热。
是试剂本身的质量评价，符合一定 要求后才能生产供应；一是在临床应用中效果的 评价。
• 以肝炎ELISA诊断试剂为例，首先必须通过中国药
品生物制品检定，以得到生产的许可。检定内容 除包装、标签、说明书等外，对试剂的性能，如 特异性、灵敏度、精密度和线性等均需逐项确定， 通过对一系列参比品的检测，结果符合要求者才 为合格。临床质量评价是用该试剂对临床样本进 行检测，以观察其实际应用价值。
标记免疫技术的分类
标记免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检 测方法，即应用制备好的特异性抗原或抗体 作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。
• 根据用途分为免疫组化技术（用于组织切片
或其他标本中抗原或抗体的定位）和免疫测 定（用于液体标本中抗原或抗体的测定） 。
• 根据标记物可分为：荧光抗体技术、放射免
发展为硝酸纤维素膜，活化滤纸，磁珠，或在聚 苯乙稀微孔表面偶联上各功能基团。
• 其它标记免疫分析相结合，荧光酶免疫分析
（FEIA）增强化学发光酶免疫分析（ECLEIA）
仪器的自动化
• Roche公司的COBAS CORE II全自动任选式EIA分析仪，以
塑料珠为固相载体，以辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体， 以TMB为显色底物，可检测40多个项目。
ELISA的原料
• 固相的抗原或抗体 • 酶标记的抗原或抗体 • 酶作用的底物
抗原
• 抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。
抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细 胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合 的物质。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分 子量大于5000的蛋白质，例如乙型肝炎病毒表面 抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）等。小分子化 合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特 异性抗体的，称为半抗原（hapten）。例如某些 激素、药物等。
双抗原夹心法测抗体 （ HBsAb）
双抗原夹心法测抗体
• 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性
抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相 应的抗体。
间接法测抗体（HCV)
间接法测抗体
• 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为
利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗 体）以检测与固相抗原结合的受检抗体。
• 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利
• 比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着
的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的 比色架中。
结果判断
• 在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深
于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴 性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判 断方法不同。
ELISA试剂的临床质量评价
• ELISA试剂的评价（evaluation）分两个方面：一
两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心 法进行测定，可以采用竞争法模式 。
• 其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗
原竞争与固相抗体结合 。
• 小分子激素、药物等ELISA测定多用此法 。
捕获包被法测抗体
捕获包被法测抗体
• 在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包
被法，常用于病毒性感染的早期诊断 。
的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留 在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物 质，以及在反应过程中非特异性地吸附于 固相载体的干扰物质。
• 操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
显色
• 显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时
酶催化无色的底物生成有色的产物。反应 的温度和时间仍是影响显色的因素 。
比色
标准品和控制血清（定量检测）
• 洗涤液 • 终止液
ELISA的操作要点
• 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是
保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。
操作时应注意以下几点：
• 标本的采集和保存 • 试剂的准备 • 加样 • 保温 • 洗涤 • 显色和比色 • 结果判断
标本的采集和保存
• 可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血
• 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,
HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备， 所以最常用
• HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过
氧化物为H2O2，其反应式如下：
HRP
• DH2＋H2O2────→D＋2H2O
上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在 ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成 为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体 有邻苯二胺(Ophenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺
抗体
• 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白
(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、 IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的 Ig主要为IgG和IgM。
固相载体
• 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和
容器，不参与化学反应。可作载体的材料 很多，主要有聚苯乙烯和聚氯乙烯两种， 具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋 白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学 活性，。最常用的是聚苯乙烯。
(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)
• OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反后，
在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便， 是HRP结合物最常用的底物。曾有报道OPD有致 异变性，操作时应予注意。 。
• TMB经HRP作用后产物显蓝色，目视对比鲜
明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，直 接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等 优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反 应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色 呈黄色，最适吸收波长为450nm
试剂的准备
• 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的
试剂 。
• 从冰箱中取出的试剂和待检样本应待温度
与室温平衡后使用 。
加样
• 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，
加酶结合物，加底物。加样时应加在微孔 板的底部，并注意不可溅出，尽量避免产 生气泡。
• 加标本一般用微量加样器，按规定的量加
用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方 法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。
竞争法测抗体 （Anti-HBc)
竞争法测抗体
• 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不
易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测 特异性抗体。
• 其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗
体竞争与固相抗原结合 。
竞争法测抗原
• 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的
• 先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标
本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性 IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗 原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加 酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物 作用，呈色即与标本中的IgM成正相关 。
ELISA试剂盒常用组份
• 已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂） • 酶标记的抗原或抗体（结合物 ） • 酶的底物 • 阴性对照品和阳性对照品（定性检测）参考
如在抗原抗体反应后Ab*Ag中的标记物*失去其特性，例如酶 失去其活力，荧光物质不显荧光，则不需要进行Ab*Ag与 Ab*的分离，可以直接测定游离的Ab*量，从而推算出标 本中的Ag含量，这种方法称为均相法。
ELISA的原理
• ELISA的这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体 结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体， 这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留 酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的 抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与 固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方 法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物 质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中 受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物 后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标 本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应 的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率 很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方 法达到很高的敏感度。
清）、分泌（唾液）和排泄物（如尿液、粪便） 等。
• 大部分ELISA检测均以血清、血浆为标本。
• 应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧
化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中， 溶血标本可能会增加非特异性显色 。
• 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中
可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
疫分析、酶免疫技术 、化学发光免疫技术 和金标免疫和Perlmann发表了酶联免疫
吸附剂测定(ELISA）用于IgG定量测定的文 章,使得用于抗原定位的酶标抗体技术发展 成液体标本中微量物质的测定方法。
• 酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游
入板孔中 。
• 每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污
染。
温育
• 抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和
时间，这一保温过程称为温育 。
• 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和
4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用 的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的 合适温度。
•
洗涤
• ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合
离的酶标记物而分为均相（homogenous）和异相 （heterogenous）两种类型 。
• 如以标记抗体检测标本中的抗原为例，其反应式如下：
Ab*＋Ag→Ab*Ag＋Ab*
如在抗原反应后，先把Ab*Ag与Ab*分离，然后测定Ab*Ag或 Ab*中的标记物的量，从而推算出标本中的抗原量，这种 方法称为异相法。
ELISA的类型
• 双抗体夹心法测抗原（HBsAg、 HBeAg等）
双抗体夹心法测抗原
• 适用于检验各种蛋白质等大分子抗原 ，这
种双位点夹心法具有很高的特异性，而且 可以将受检标本和酶标抗体一起保温作一 步检测。
• “HOOK效应” ：在一步法测定中，当标
本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分 别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形 成"夹心复合物"如按常法测读，所得结果将 低于实际的含量 。
• BM公司（现属Roche公司）ES600型全自动EIA分析仪，
该系统可测定病毒标志物，治疗药物，激素，肿瘤标志物 等60余项目。
• 美国Johnson OCD公司的Vitros Eci全自动任选式增强化学
发光免疫分析系统，此仪器将酶免疫技术，生物素亲合素 技术和增强化学发光技术相结合。
• 美国DPC公司的IMMLITE2000型全自动任选式酶标记抗原
•技术的进步 •仪器的自动化 •临床应用
EIA的技术进步
• 抗体制备技术的进步使检测范围日益扩展，使小
分子抗原，半抗原的检测成为事实。
• 酶标记技术的进步，从过氧化物酶，扩展到碱性
磷酸酶，B半乳糖苷酶，尿毒酶，葡萄糖氧化酶， 葡萄糖6磷酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶。
• 改进固相载体的技术，由聚苯乙稀微孔（珠），
ELISA试剂质量考核指标
• 从临床应用角度考核检验试剂的可靠性，
是以其能否区分健康与疾病的能力作为依 据的。
• 目前还很难找到100%可靠的试验，任何试
验都会出现假阳性或假阴性。
• 试验的可靠性常以其灵敏度及特异性作为
考核标准。灵敏度（阳性的检测百分率） 特异性（阴性的检测百分率）
酶免疫分析技术及应用进展
• 固相载体以形式分有：微孔板、磁性微珠
和小试管。以微孔板最为常用。
酶与底物
• 凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均
可作为标记用。
• 应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比
活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法 测定。
• 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶
(HRP)和硷性磷酸酶(AP)
• 体液中微量蛋白定量 • 细胞因子，细胞间粘附因子，生长因子的定量 • 基因表达蛋白的检测 • 其他各种恒量代谢物，神经介质，激素介质，活性激素，
多能上能下胺类代谢物，及细胞内信使的定量
• 因此，凡是可取得抗体或纯品抗原者均可用EIA完成定量，
或抗体
EIA的临床应用
• 检测范围日益扩展，目前主要用于 ： • 激素及其受体的检测。 • 肿瘤标志物检测。 • 病原微生物的抗体及可溶性抗原的检测，是诊断各种病原
微生物感染的重要手段，如病毒、细菌、螺旋体、支原体、 衣原体、立克次体等，尤其是其在体液中可溶性抗原的检 出可实现早期诊断。以检测体内病原体抗原的检查代替抗 体检查已成为发展趋热。
是试剂本身的质量评价，符合一定 要求后才能生产供应；一是在临床应用中效果的 评价。
• 以肝炎ELISA诊断试剂为例，首先必须通过中国药
品生物制品检定，以得到生产的许可。检定内容 除包装、标签、说明书等外，对试剂的性能，如 特异性、灵敏度、精密度和线性等均需逐项确定， 通过对一系列参比品的检测，结果符合要求者才 为合格。临床质量评价是用该试剂对临床样本进 行检测，以观察其实际应用价值。
标记免疫技术的分类
标记免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检 测方法，即应用制备好的特异性抗原或抗体 作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。
• 根据用途分为免疫组化技术（用于组织切片
或其他标本中抗原或抗体的定位）和免疫测 定（用于液体标本中抗原或抗体的测定） 。
• 根据标记物可分为：荧光抗体技术、放射免
发展为硝酸纤维素膜，活化滤纸，磁珠，或在聚 苯乙稀微孔表面偶联上各功能基团。
• 其它标记免疫分析相结合，荧光酶免疫分析
（FEIA）增强化学发光酶免疫分析（ECLEIA）
仪器的自动化
• Roche公司的COBAS CORE II全自动任选式EIA分析仪，以
塑料珠为固相载体，以辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体， 以TMB为显色底物，可检测40多个项目。
ELISA的原料
• 固相的抗原或抗体 • 酶标记的抗原或抗体 • 酶作用的底物
抗原
• 抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。
抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细 胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合 的物质。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分 子量大于5000的蛋白质，例如乙型肝炎病毒表面 抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）等。小分子化 合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特 异性抗体的，称为半抗原（hapten）。例如某些 激素、药物等。
双抗原夹心法测抗体 （ HBsAb）
双抗原夹心法测抗体
• 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性
抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相 应的抗体。
间接法测抗体（HCV)
间接法测抗体
• 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为
利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗 体）以检测与固相抗原结合的受检抗体。
• 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利
• 比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着
的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的 比色架中。
结果判断
• 在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深
于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴 性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判 断方法不同。
ELISA试剂的临床质量评价
• ELISA试剂的评价（evaluation）分两个方面：一
两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心 法进行测定，可以采用竞争法模式 。
• 其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗
原竞争与固相抗体结合 。
• 小分子激素、药物等ELISA测定多用此法 。
捕获包被法测抗体
捕获包被法测抗体
• 在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包
被法，常用于病毒性感染的早期诊断 。
的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留 在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物 质，以及在反应过程中非特异性地吸附于 固相载体的干扰物质。
• 操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
显色
• 显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时
酶催化无色的底物生成有色的产物。反应 的温度和时间仍是影响显色的因素 。
比色
标准品和控制血清（定量检测）
• 洗涤液 • 终止液
ELISA的操作要点
• 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是
保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。
操作时应注意以下几点：
• 标本的采集和保存 • 试剂的准备 • 加样 • 保温 • 洗涤 • 显色和比色 • 结果判断
标本的采集和保存
• 可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血
• 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,
HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备， 所以最常用
• HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过
氧化物为H2O2，其反应式如下：
HRP
• DH2＋H2O2────→D＋2H2O
上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在 ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成 为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体 有邻苯二胺(Ophenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺
抗体
• 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白
(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、 IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的 Ig主要为IgG和IgM。
固相载体
• 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和
容器，不参与化学反应。可作载体的材料 很多，主要有聚苯乙烯和聚氯乙烯两种， 具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋 白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学 活性，。最常用的是聚苯乙烯。
(3,3‘,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)
• OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反后，
在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便， 是HRP结合物最常用的底物。曾有报道OPD有致 异变性，操作时应予注意。 。
• TMB经HRP作用后产物显蓝色，目视对比鲜
明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，直 接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等 优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反 应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色 呈黄色，最适吸收波长为450nm