LPS、TNF-α、IL-1β刺激RAW264.7细胞分泌NO的比较

DOI:10.16659/ki.l672-5654.2017.14.003
LPS、TNF-a、IL-ip 刺激 RAW264.7 细胞分泌
N O的比较
殷津津、辛文妤2
1.山东省青岛市城阳区惜福镇街道卫生院药剂科，山东青岛266106曰
2.山东省滨州医学院，山东烟台264003
[摘要]目的研究LPS、T N F-a、I L-1p刺激R A W264.7细胞分泌N O的剂量、时间依赖性关系，为建立炎症细胞模型提 供实验依据。

方法以 L P S(0.01、0.10、1.00、10.00 滋g/m L)、T N F-a(0.10、1.00、10.00、100.00 ng/m L)或 IL-1茁（0.10、1.00、
10.00、100.00 ng/mL)刺激R A W264.7细胞，24 h后收集细胞上清液G reiss法测定N O的含量。

以L P S(1滋g/m L)、T N F-a
(10 ng/m L)或IL-1P(10 ng/m L)分别刺激R A W264.7细胞6、12、24、48 h，收集细胞上清液G reiss法测定N O的含量。

结果不同剂量L P S均可显著诱导R A W264.7细胞分泌大量N O,无明显的剂量依赖性，不同剂量TNF-琢或IL-叩均可 显著诱导R A W264.7细胞分泌N O,且有一定的剂量依赖性，L P S(1滋g/m L)或T N F-a(10ng/mL)刺激R A W264.7细胞 12~48 h时N O的分泌量显著升髙，IL-1P(10 ng/mL)刺激6~48 h均可显著诱N O的分泌，均具有一定的剂量依赖性。

结论0.01~10.00滋g/mL LPS、0.10~100.00 ng/m L的TNF-琢或IL-1P刺激R A W264.7细胞均可成功复制炎症细胞模型。

[关键词]炎症、R A W264.7 细胞、LPS、T N F-a、I L-l茁
[中图分类号]R965 [文献标识码]A [文章编号]1672-5654(2017)05(b)-0003-04 Comparison of LPS, TNF -琢，IL -1茁in Stimulating NO Secreted by RAW264.7 Cell
YIN Jin-jin', X IN W en-yu2
[Departm ent of Pharmacy, Street Health Center of Xifu Town, Qingdao, Shandong Province, 266106 China;2. Binzhou Medical College, Yantai, Shandong Province, 264003 China
[Abstract] O bjective To research the correlation between the LPS, T N F-a, IL-1茁in stimulating NO secreted by RAW264.7 cell and time dependence and provide experimental basis for the establishment of inflammatory cell model.
M ethods TheLPS(0.01,0.10，1.00，10.00 滋g/m L),TNF-a(0.10，1.00，10.00，100.00ng/m L)andIL-1茁(0.10，1.00，10.00，100.00ng/mL) were used to stimulate the RAW264.7 cell, after 24h, the NO content was measured by the Greiss method, and the LPS(1 滋g/mL), T N F-a (10 ng/mL) or IL-1茁（10 ng/mL)were used to stimulate RAW264.7 cell for 6，12,24,48 h, and the NO content was measured by collecting the cell supernatant Greiss method. R esults Different doses of LPS could obviously induce the NO secreted by RAW264.7 cells without obvious dose dependency, and different doses of T N F-aor IL-1茁could cann obviously induce the NO secreted by RAW264.7 cells with a certain dose dependency, and the NO secretion volume was obviously increased after LPS (1 滋g/mL)or T N F-a (10 ng/mL)，and IL-1茁(10 ng/mL)stimulation for 6〜48 h could obviously induce the secretio n o fN O w ith acertain d ose dependency. C onclusion 0.01〜10.00 滋g/mL LPS and 0.10〜100.00 ng/mL T N F-a or IL-1茁in stimulating the RAW264.7 cell can successfully duplicate inflammatory model.
[K ey words] Inflammation; RAW264.7 cell; LPS; T N F-a; IL-1茁
炎症是多种疾病的一个重要标志特征，是机体对内 [基金项目]山东省博士基金资助项目(BS2014YY049)曰烟台市科技计划资助项目（2014ZH092);科研启动基金(BY2013KYQD09)。

[作者简介]殷津津（1985-)，女，山东青岛人，硕士，主管药师，研究方向:靛红的抗炎作用研究，七叶皂苷钠防治术后肠粘连 研究等。

[通讯作者]辛文妤（1985-)，女，山东潍坊人，博士，讲师，研究 方向：炎症与疾病，E-m ail:xinwenyu1391139@。

外有害刺激因素做出的自我保护性反应。

虽然炎症在一 定程度上对机体是有利的，但过度或过久的炎症反应往 往会加重许多疾病的发展，如自身免疫性疾病、脓毒症、癌症、动脉粥样硬化、糖尿病等[1-2]。

巨噬细胞是一类重要 的免疫细胞，在机体炎症反应中发挥重要作用'小鼠巨 噬细胞RAW264.7细胞来源于小鼠腹腔，是可以永生化 的巨噬细胞株，能够稳定进行传代培养'
中国卫生产业 3
LPS是革兰阴性菌细胞壁的的重要组成成分，是引 起炎症的一类重要诱导剂，LPS与其受体结合后通过一 系列信号通路如NF-k B信号通路，诱导多种炎症介质 的释放[5]。

以LPS诱导RAW264.7细胞在一定程度上可 以模拟机体的炎症反应，是目前常用的体外炎症细胞模 型[6^7]。

此外，TNF-a、IL-l(3是炎症反应中最常见的炎症 因子，TNF-a是机体应激反应中的核心炎症介质，可诱 发血管内皮细胞的表型变为炎症型，导致机体代谢和血 液动力学改变，促进炎症介质生成，是导致炎性因子“瀑 布效应，，的“元凶，，'IL-1(3是一种能够激活多种免疫和 炎症细胞的前炎性细胞因子，在感染、炎症、免疫应激等 细胞反应中发挥了重要的作用[9]。

LPS、TNF-a、IL-1茁均 可以诱导RAW264.7细胞发生炎症反应，用于抗炎药物 的筛选及其作用机制的评价。

该文主要观察不同剂量 LPS、TNF-a、IL-1茁诱导RAW264.7细胞不同时间后NO分泌量的比较，为建立更理想的炎症细胞模型提供 参考。

1材料与方法
1.1材料
小鼠巨噬细胞RAW264.7由该实验室前期冻存；LPS、TNF-a、IL-i p购自美国sigma公司。

胰蛋白酶、胎 牛血清购自美国sigma公司；DMEM培养基购自美国 Invitrogen公司。

1.2实验方法
1.2.1细胞培养小鼠巨噬细胞RAW264.7在37益、5%c C〇2、饱合湿度条件下用含10%C胎牛血清的DMEM培养 液传代培养。

1.2.2 不同剂量 LPS、TNF-a、IL-l茁诱导 R A W264.7 细胞分泌NO的比较取刚刚长成完整单层的RAW264.7 细胞一瓶，胰蛋白酶消化后吹打细胞，调整细胞数目至 2伊105cell/mL。

于96孔细胞培养板中每孔加人100滋L 细胞悬液，置于CO2培养箱中继续培养12 h。

取出培养 板后吸掉原培养液，每孔加人190滋L无血清培养液。

6 h 后加人 10 滋L LPS(终浓度为 0.01、0.10、1.00、10.00 滋g/mL)，或 10 滋L TNF-a(终浓度为 0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL)或 10 滋L IL-1P(终浓度为 0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mL)，另设正常对照组。

然后于微孔板振荡器上振荡混匀，置 于C〇2培养箱中分别继续培养24 h。

收集培养上清液，Greiss测定NO的含量。

取细胞上清液100滋L加人到96孔板中，加人100滋L Griess试剂(0.2%6萘基乙二胺和含2%c磺胺的0.5%c磷酸 按1:1比例混合），于微孔板振荡器上振荡使之混匀，室 温避光静置10 min，用酶标仪于540 nm波长处测定吸光 度值。

计算NO分泌率=(样品孔OD-空白孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD)x100%。

1.2.3 LPS、TNF-a、IL-lp 诱导 R A W264.7 细胞不同 时间分泌NO的比较取RAW264.7细胞一瓶，胰蛋白酶 消化后收集细胞，用移液管吹打均匀，调整细胞数目至 2x105cell/mL。

于96孔细胞培养板中每孔加人100滋L 细胞悬液，置于C〇2培养箱中继续培养12 h。

取出培养 板后吸掉原培养液，每孔加人190滋L无血清培养液。

6 h 后加人10滋L LPS(终浓度为1滋g/mL)或10滋L TNF-a (终浓度为10 ng/mL)或10滋L IL-1P(终浓度为10 ng/mL)，另设正常对照组。

加人LPS后，于微孔板振荡器上振荡 混匀，置于C〇2培养箱中分别继续培养6、12、24、48 h。

收 集培养上清液，Griss测定NO的含量，计算NO分泌率= (样品孔OD-空白孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD)x100%。

2实验结果
2.1 不同剂量LPS、TNF—a、IL—1茁诱导RAW264.7 细 胞分泌N O的比较
正常对照组RAW264.7细胞分泌NO的量极低，加 人不同剂量的LPS、TN F-a或IL-1P刺激后NO分泌量 均显著提高。

加人0.01、0.10、1.00、10.00滋g/mL刺激后 NO分泌量均显著提高，随着LPS剂量的增加，NO的分 泌略微增加。

加人 0.10、1.00、10.00、100.00 ng/mLTNF-a 或IL-1P刺激后NO分泌量均显著提高；随着TNF-a 或IL-1P剂量的增加，NO的分泌量逐渐增加，且有一定 的剂量依赖性(图1)。

2.2 LPS、TNF—a、IL—1p刺激 RAW264.7 细胞不同时间致N O分泌的变化
正常对照组RAW264.7细胞分泌NO的量极低，加 人LPS、TNF-a或IL-1P刺激后NO分泌量显著提高。

与 正常对照组相比，加人LPS或TNF-a6 h后NO分泌量 略微提高，随着LPS或TNF-a刺激时间的延长，NO分泌 量逐渐增加，12、24、48 h组与正常对照组相比具有显著 性差异，其中在48 h时NO分泌量达到高峰期。

加人 IL-1P在6、12、24、48 h与正常对照组相比均具有显著 性差异，其中在48 h时NO分泌量达到高峰期(图2)。

3讨论
炎症是十分常见而重要的基本病理过程，可发生于 机体的任何部位和任何组织，参与人类的大多数疾病。

目前临床上常见抗炎药物包括院非甾体抗炎药、糖皮质激 素类、生物制剂、中草药制剂等。

但这些药物存在疗效不 确定、毒副作用明显、价格昂贵等问题。

因此，积极寻找 有效、不良反应低、能够长期使用的抗炎药物一直是医 药工作者关注的热点。

建立体外炎症细胞模型具有简单、高效、便捷等诸多优点。

因此，以炎症细胞为模型进行抗 炎药物的筛选及评价成为科研人员关注的焦点。

该文主
4中国卫生产业
图1 不同剂量的LPS(A)、T N F-a(B)、IL-1茁(C)
注:分别加人不同剂量的LPS(A)、TNF-a(B)、IL-1p(C)刺激RAW264.7细胞，均引起NO分泌量显著提高。

分别加人LPS(终浓度为0.01、0.1、1、10滋g/mL)、10 滋L T N F-a(终浓度为 0.1、1、10、100ng/mL)、10 滋L IL-1茁（终浓度为0.1、1、10、100ng/mL)朿I J激 RAW264.7 细胞 24 小时遥 Greiss方法测定NO含 量遥NO分泌率与对照组比，差异有统计学意义（*P<0.05和**P<0.01)D
注:分别加人LPS(A)、TNF-a(B)、IL-1p(C)刺激RAW264.7细胞，不同时间段均引起NO分泌量显著提高。

分别加人L P S(1滋g/mL)、TNF-a(10ng/ml)、IL-1茁(10ng/mL)刺激RAW264.7细胞，测定0、6、12、24、48小时细胞的NO分泌量遥数据分析显示，NO分泌率与对照组相比差异有统计学意义(*P<0.05和**P<0.01)D
中国卫生产业 5
要通过观察不同剂量LPS、TNF-a、IL-i p诱导RAW264.7 细胞不同时间后NO的分泌量，寻找合适的刺激物剂量 及刺激时间，为更好地进行抗炎药物的筛选及评价奠定 基础。

NO的过量生成与炎症反应密切相关，是一种重要的 炎症介质。

正常情况下内皮源性NO具有抑制炎症反应 的作用，而在病理情况下诱导型NO合成酶合成大量的 NO则有细胞不良反应，加重炎症反应，参与多种疾病的 发展™。

在该实验中，主要通过检测NO的分泌量来评价 LPS、TNF-a、IL-i p诱导RAW264.7成为炎症细胞模型 的标准。

NO的测定采用Greiss法，该方法操作简单，只需一步反应，时间为10 min，并且价格低廉、灵敏度高、可用于大批量的药物筛选或抗炎活性评价。

因此，该实 验选择通过测定NO含量来初步评价炎症细胞模型。

实 验结果显示，LPS 在 0.01、0.10、1.00、10.00 滋g/m L各剂 量均可以刺激RAW264.7细胞分泌大量的NO,剂量依赖 性不明显。

TNF-a、、L-l茁在 0.10、1.00、10.00、100.00 ng/m L 各剂量均可以刺激RAW264.7细胞分泌大量的NO,且具 有一定的剂量依赖性。

此外，该研究选取1滋g/m L LPS、10 ng/m L TNF-a或 IL-1P刺激RAW264.7细胞的。

结果显示，LPS或TNF- 琢刺激6h时NO的分泌量与正常对照组无显著性差异，复制模型不成功;仅在12~48 h均可以成功复制模型;而 IL-1P在6~48 h均可以刺激NO的大量分泌，有一定的 时间依赖性，可成功复制模型。

据文献报道，LPS多采用0.2~1滋g/mL刺激RAW264.7细胞18-24 h进行炎症细 胞模型的复制[11-1；l W eiweiLi等人采用10 ng/m L TNF-琢诱 导RAW264.7细胞24 h为炎症细胞模型，进行药物的抗 炎活性评价[14。

综上所述，0.01~1.00 滋g/m L LPS刺激 RAW264.7 细 胞 24 h，以及 0.1~100.00 ng/m L的 TNF-a或 IL-1P刺激 RAW264.7细胞24 h均可以成功复制炎症细胞模型。

在 实验中如何选取LPS、TNF-a、IL-1p的剂量以及刺激时 间，炎症细胞模型过重或过轻都不利于抗炎药物的评价 或筛选。

应综合考虑，结合细胞状态、细胞密度，以及刺 激物的纯度、厂家、批次等自身实验条件进行选取。

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(收稿日期:2017-02-11)
6中国卫生产业。