微生物降解酚类化合物的研究进展

微生物降解酚类化合物的研究进展
李淑彬;陈振军
【摘要】酚类化合物是多种工业生产过程中排放的有毒污染物. 从微生物对酚类化合物降解的生化机制和关键酶、高效降酚微生物菌种的分离筛选和降解特性以及利用微生物细胞固定化技术处理酚类污染物的研究进展等方面对微生物降解酚类化合物研究进行综述,并对应用高效菌种处理含难降解污染物废水的前景和存在问题进行简要评述.
【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2005(000)004
【总页数】7页(P136-142)
【关键词】酚类化合物;微生物;降解
【作者】李淑彬;陈振军
【作者单位】华南师范大学生命科学学院,广东广州,510631;华南师范大学生命科学学院,广东广州,510631
【正文语种】中文
【中图分类】Q935
酚类化合物是一类原生质毒物，对几乎所有生物均有毒杀作用，尤其对人体神经系统危害较大，其中苯酚、间甲酚都属于饮用水水源中需严格控制的污染物质.酚可使蛋白质凝固，水溶液中的酚可被皮肤吸收而引起中毒，含酚污水可使水中的生物
死亡.当水源水中酚类化合物的质量浓度为0.002 mg/L时，加氯消毒就会产生氯
酚恶臭；质量浓度超过0.00 5mg/L，水就不能饮用.因此，降低废水中的含酚量已成为当务之急[1].
引起环境污染的酚类化合物主要包括苯酚和氯酚.苯酚是造纸、炼焦、炼油、塑料、纺织等化学工业产生的废水中的主要污染物，它进一步与水中的氯作用产生的氯代酚是一种毒性更强的有机污染物.苯酚及其衍生物在水体中的扩散，对生态环境造
成了损害，也威胁着人类的健康，因此美国环保署把苯酚列入优先污染物和65种有毒污染物之列，我国也把苯酚列入中国环境优先污染物“黑名单”之中[2].
氯酚类化合物(CPS)被广泛用作木材防腐剂、防锈剂、杀菌剂和除草剂等，在亚洲、非洲和南美洲还用于血吸虫病的防治，其中2，4—二氯酚(DCP)和2，4 ，5—三氯酚(TCP)还大量用于农药，因此在许多工业化国家CPS的生产规模非常庞大.氯
酚的毒性随其氯化程度的增加而增加，2—氯酚、2，4—二氯酚、2，4，6—三氯酚和五氯酚都是毒性很高的物质.酚类化合物的大量使用，使得大量的CPS污染物进入了环境，这类化合物在水中的溶解度大，结构稳定，不容易分解和转化，它们在自然界中的不断累积，给自然环境造成很大的危害.因此，清除环境中的该类化
合物是人类面临的一大挑战[7，24].
对含苯酚、氯酚等酚类化合物的废水处理手段主要有两大类[3～6]一类是通过物理或物化方法处理，如萃取法、吸附法、超声—过氧化氢联合法、湿式催化氧化法、超临界水氧化法、高压脉冲法等.前两者操作简便，但成本较高，用于生产上不经济；后几种方法属于当前的研究热点，但处理成本高，处理规模小，基本上还处于实验室研究阶段.另一类是生物处理方法，最常用的是传统的活性污泥法.活性污泥
法是一种以活性污泥为主体的废水处理方法.该法目前已成为钢铁、焦化、煤气、
炼油、木材防腐、合成橡胶、染料等工业废水治理的主要方法,该方法具有设备简单、处理条件温和、处理效果好、受气候条件影响小、二次污染小等优点.微生物
作为废水处理中活性污泥的主体，是有毒物质分解转化的主要执行者.微生物处理
法从自然界中筛选分离出能够降解特定污染物的高效微生物菌种，研究探讨其降解特性，通过生物固定化技术，有针对性地投加到已有的污水处理系统中，在有毒有害污染物治理中显示出巨大的潜力.
1 降酚微生物的主要类群
近几十年来，研究者们已从该类物质长期污染的环境中或相应的活性污泥中分离到大量的能降解酚类化合物的微生物.这些微生物主要包括：(1)细菌类.如根瘤菌(Rhizobia)、醋酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)、假单胞菌(Pseudonomonas.sp)、真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)、反硝化菌(Denitrifiying bacteria)、黄杆菌(Flavobacterium)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepaciaps )、罗尔斯通
菌(Ralstonia)、红球菌(Rhodococcus)等；(2)丝状真菌类.如镰刀菌(Fusarium)、白腐真菌(Phanerochaete)、青霉菌(Penicillium)等；(3)酵母菌类.如假丝酵母菌(Candida)、麦芽糖假丝酵母(Landidamaltosa)、皮状丝孢酵母菌(Trichosporon cutaneum)等.此外一些藻类也参与了苯酚类物质的降解过程.其中假单胞菌是降解氯酚类化合物最常见的微生物，不仅能降解多种氯酚，而且能降解氯苯、多氯联苯、硝基苯和多环芳烃等近100种有毒物质[10～12].黄孢原毛平革菌(Phanerochate chrysosporium)是对氯代酚化合物具有非专一性降解作用的真菌，还能降解菲、
葱等多环芳烃和多氯联苯及其各种染料等[13].
2 微生物降解酚类化合物的机制和关键酶
国内外学者对酚类化合物的生物降解机制进行了很多的研究，特别是苯酚、氯酚的降解机制、代谢途径，目前已有较为统一的认识.苯酚的微生物降解大多在好氧的
条件下进行.在有氧的条件下，苯酚首先分解为邻苯二酚，邻苯二酚由邻位和间位
途径经环裂解，最后形成三羧酸循环中间物.邻位和间位途径是两个独立的代谢系统,邻位途径产生β—酮基己二酸中间产物，间位途径产生α—酮基己二酸中间物
[14～17].氯酚类化合物在不同条件下的降解路径不同，在好氧条件下，单氯酚和
二氯酚在氧化酶的攻击下形成氯代邻二酚，邻二酚开环生成相应的氯代粘康酸或半醛，粘康酸内酯化过程中释放氯离子；高度氯代的化合物则是在氢氧化酶作用下生成氯代醌，并逐步脱去所有的氯原子生成苯酚后才开环.在厌氧或缺氧条件下，氯
酚进行还原脱氯，在得到电子的同时去掉一个氯取代基[7].
苯酚降解过程中，苯酚降解途径的第一个酶——苯酚羟化酶是降解苯酚的关键酶，该酶负责将苯酚转化为邻苯二酚；将邻苯二酚开环裂解为三羧酸产物，是由邻位和间位酶负责的.尽管微生物降解苯酚类物质具有不同的途径和酶系统，却均产生同
一类酶——邻苯二酚2，3—双加氧酶(C23O，间位裂解)或1，2—双加氧酶(CatA，邻位裂解)，将中间产物——邻苯二酚进行开环裂解.这类双加氧酶(C23O，Cat A)在不同的降解菌中具有高度的同源性[17].
参与2，4—DCP降解的多个酶中，起始几步降解反应的酶即2，4—DCP羟化酶、3，5—二氯儿茶酚1，2—双加氧酶、氯粘康酸环异构酶、反式氯双烯内酯异构酶和氯双烯内酯水解酶是关键酶.大量研究表明，微生物降解有机污染物的基因通常
与质粒有关.对很多氯代芳香化合物来说，往往是降解性质粒参与编码降解途径的
一部分，剩余部分由染色体基因控制.根据对真氧产碱杆菌JMP134( pJP4)对2，4—D的降解过程及其控制基因的研究，从2，4—D至氯代马来乙酸之间降解过
程受质粒pJP4控制，氯代马来乙酸及之后的降解过程受染色体控制.从这些情况来推测dcpA基因可能位于质粒上[18].
3 微生物对酚类物质的降解特性研究
沈锡辉[19]等分离到一株能以苯酚、苯甲酸、对甲酚、苯为唯一碳源和能源生长、具有同时降解单环和双环芳烃能力的细菌菌株，经生理生化、16SrRNA基因序列分析等鉴定为红球菌PNAN5菌株.在温度为20～40℃，pH7.0～9.0范围内该菌
株降解苯酚的效率保持在80%～100%之间，苯酚浓度在2～10 mmol/L范围内
变化对降解效率没有明显的影响.该菌株通过邻苯二酚1，2-双加氧酶催化的开环
途径降解芳烃，不同于已知的浑浊红球菌，后者是通过邻苯二酚2，3-双加氧酶催化芳烃降解.
刘慧等[20]探讨了初始苯酚浓度、TOC以及酵母生物量间的相互关系.结果表明，
苯酚的降解同酵母生长有极大的相关性，初始苯酚浓度升高，抑制酵母生物量增加，转化率下降；在苯酚的降解过程中，TOC的下降与苯酚同步，苯酚完全降解后TOC主要来自酵母代谢产物.对于初始苯酚质量浓度为559.0 mg/L的培养液，降
解90%的苯酚可获得酵母328.2 mg(生物量)/L，并可使培养液TOC降解约
87.3%.
宋波[21]等对南充市郊炼油厂活性污泥进行富集、驯化筛选得到2株能以苯酚作为唯一碳源和能源生长的菌株，分别编号为S1、S2，在苯酚质量浓度<300 mg/L 时，该两株细菌对苯酚降解率均高于60%.实验得出其最佳生长条件为pH 7～8，温度25～30℃.向述荣等[22]对分离筛选到的一株高效苯酚降解菌phen8(假单胞菌)的底物降解特性进行了分析，并筛选出4株缺失苯酚降解功能的突变株.结果表明，在苯酚初浓度为0～7 mmo1/L时，苯酚降解菌phen8的菌体密度和降解率与培养基中的苯酚初浓度成正比，而大于7 mmo1/L的苯酚则明显地抑制降解反应.葡萄糖对苯酚的降解也表现出明显的抑制作用.与对照相比，在含有葡萄糖的基
本培养基中培养20 h后，菌体对苯酚的降解率减小47.2%.
陈明、张维、徐玉泉等[23]用从炼油厂污水中分离的醋酸不动杆菌PHEA-2研究降解苯酚的能力，发现该菌种对苯酚有较强的降解能力.在温度30℃和接种量为1%
条件下，在24 h内完全降解苯酚的质量浓度为300 mg/L，而且降解反应遵从Monod模式.他们还用经多次驯化的菌种来做降解苯酚的研究，从pH、温度等方面考察了该菌的降解特性，得出最佳温度为30℃和pH在5～9之间的结论.
另外，任源等[24]用从处理废水系统中的活性污泥里分离、驯化得到的菌种来处理
油制气废水，并对其降解特性进行了研究.发现该菌对酚类化合物的去除率达95.4%～97.0%，还考察了其他营养源对降解率的影响，他们的研究结果表明葡萄糖、乙醇的加入可提高菌种对CODCr和氨氮的去除率.
钟文辉等[25]从土壤中分离到两株能以2，4—二氯酚为唯一碳源和能源生长的、具有降解2，4—二氯酚能力的假单胞菌属细菌GT241-1和GT141-2.菌株
GT241-1和菌株GT141-2在最适温度25～30℃下，能将60～100 mg/L的2，4—二氯酚分别降解到8～12 mg/L和25～30 mg/L.经驯化的活性污泥在投加污泥总量0.59% (以干重计)的GT241-1菌体后，对含2，4—二氯酚60 mg/L和COD 1 500 mg/L的模拟废水分批处理20 h左右后可使2,4—二氯酚含量降到最低值9 mg/L.
黄俊等[26]采用室内培养法，研究了白腐真菌的典型菌种——黄孢原毛平革菌对典型浓度的五氯酚(PCP)溶液的好氧生物降解.结果表明，在常温条件下，经过6 d 时间，初始浓度为20 mg/L的PCP接近完全降解，效果非常显著.对实验所获得的时间序列数据进行动力学分析，发现该菌对PCP的生物降解反应遵循准一级动力学.
宋建华等[27]从处理曾受五氯酚污染的废水处理设施的活性污泥中经过驯化富集获得一株PCP降解菌.在24 h内，该菌对质量浓度为400 mg/L的PCP降解率在90%以上.经检测该菌属于假单胞杆菌.并从底物浓度、温度、pH、接种量和添加低浓度其他营养源方面研究该微生物对底物的降解特性.
陈勇生等[8]分离到2株可利用2，4—二氯酚为唯一碳源和能源的假单胞菌DCP-1和DCP-2.在此基础上，研究探索了菌株DCP-1降解2，4—二氯酚的影响因素和降解过程以及其遗传特性.结果表明：菌株DCP-1可降解2，4—二氯酚，并有氯离子、邻氯酚和醌积累；菌株DCP-1降解2，4—二氯酚要经历脱氯，并生成中间产物醌的过程；经检测该菌株中有一条迁移速率比pUC 18小的质粒；菌体
培养至60 h，其生长量达到最大，此时2，4—二氯酚降解率可达92%.
笔者从某钢铁厂污水中分离驯化了两株苯酚降解菌A、D，对其降解速率、生长温度、pH范围、耐受浓度等降解特性进行了初步研究.其中A菌可以在16 h将800 mg/L苯酚溶液降解完全，D菌13 h可以达到上述效果，两株菌的最高耐受浓度
均高达2 350 mg/L，其降解速率和耐受浓度在已知报道中都是较高的.
4 固定化微生物细胞对酚类化合物的降解
固定化微生物技术用于废水处理,具有一系列优点,如可在反应器内保持高生物浓度,反应启动快、处理效率高,操作稳定,产污泥量少,固液分离简单、对有毒物质的承受能力和降解能力较游离细胞高等特点.因此,该技术在难降解有机污染物治理中越来
越受到关注.表1列举了近年来细胞固定化技术对酚类物质的降解研究的一些实例. 表1 固定化微生物细胞对酚类化合物的降解被降解物质微生物/酶酶固定化载体/方法处理负荷/(mg·L-1)处理效果参考文献苯酚驯化后的活聚乙烯醇———180．76h后降解率为89%28性污泥活性炭包埋法2148．024h后降解率为50%假单胞菌海藻酸钙包埋915吸附出水9．2mg/L29假单胞菌藻阮酸钙包埋1000
去除率大于90%5恶臭假单胞菌聚乙烯醇-硼酸法100连续将苯酚浓度降低到
2．5mg/L30优势菌群聚乙烯醇冷冻改良法565去除率达94%以上，比游离菌群高10%～50%31小球藻细胞、紫色光合细菌混合菌株海藻酸钠包埋300出水0．5mg/L32假单胞菌聚矾纤维膜固定120095h内可完全降解33五氯酚活性污
泥海藻酸钙和15012h后降解率大于85%34聚乙烯醇法28016h后降解率大于75%2—氯酚白腐菌硅胶载体和轻木颗粒包埋500将80%～94%氯酚降解为CO2、H2O、和无机氯132，4，6-三氯酚厌氧和好氧污泥k角叉藻聚糖/明胶凝胶100
固定后则可以矿化，寿命延长，降解率提高．362-氯酚，2，4-二氯酚，2，4，6-三氯酚荧光假单胞菌海藻酸钙60040010050h后降解率分别达到66%，80%，50%37多氯酚混合菌固定化细胞三相流化床反应器400～430g/(m3∗d)氯释放和
氯酚去除率达99%35
5 总结和展望
从受污染的环境中分离获得高效的酚类物质降解菌，研究其降解特性，然后应用到含酚等难降解污染物的废水处理系统中，是难降解污染物的废水处理的一条有效途径；另外，固定化技术用于难降解有机物治理的研究大多是针对单一物质，且在实验室规模上进行的，要实用化，还有许多问题需要解决.
(1)含酚废水是比较普遍、危害性很严重的工业废水之一.对废水中酚类物质的脱除一直是国内外研究工作者研究的热点.但大多数研究者所研究酚的浓度较低(一般在500 mg/L以下).但实际上许多工厂，如有的焦化厂排放的废水中酚类物质的含量达几千甚至几万mg/L.对于这样高浓度含酚废水进行生物学研究和处理，目前国内外报道的还不多.
(2)实际废水是一个十分复杂的混合体系，用单一菌种处理，一般很难达到要求，因此，对于复杂的废水体系，是采用混合菌，还是单一高效菌分级处理，有待进一步探索，因此，实验室的研究与实际应用还有一段很大的距离.现在，已有学者在探讨混合基质的污染物共代谢机理，以及混合菌种体系中的生物协同作用，可以提高菌的稳定性和处理效率，将成为今后的一个发展方向.
(3)防止二次污染问题.随着基因工程的发展，在高效菌种的选育上也逐渐采用现代生物技术，如用物理、化学因子处理诱变菌株，用基因重组或细胞融合技术创建高效优势菌等.对这些诱变菌的利用要考虑在泄漏情况下该菌对周围生态环境的影响.固定化技术为充分发挥高效菌种或遗传工程菌在难降解有机物治理中的降解潜力，防止其泄露而引起生态问题提供了一个十分重要的手段.
(4)包埋载体对基质(特别是氧气)和产物存在扩散阻力，因此，需要高效曝气和混合设备才能使固定化细胞处于良好的微环境中，发挥其高效作用.
(5)固定化载体的成本及使用寿命是决定其经济可行性的关键，开发适合于固定化
微生物的高效生化反应器也是一个就亟待解决的问题.经固定化微生物处理过的废水，出水透明度一般较差，完善处理工艺，是今后需要考虑的问题.
可以预计，随着高效菌种的研究和固定化技术的不断研究和发展，在降解酚类化合物废水的处理方法中的应用必将更上一层楼.
参考文献：
[1] 李绍峰,孙连鹏,黄君礼.UV/H2O2降解酚类物质动力学研究[J].中山大学学报(自然科学版),2004,43(3):99-102.
[2] 金相灿.有机化合物污染化学-有毒有机物污染化学[M].北京：清华大学出版社.1990：250-253.
[3] 方振炜,徐德强,张亚雷，等.酚类化合物的生物降解研究进展[J].环境污染与防治,2003,4:383-388.
[4] 张海涛.我国含酚废水处理技术研究进展[J].上海环境科学，2001，2(20)：60-62.
[5] 于萍，姚琳，罗运柏.高浓度含酚废水处理的新工艺[J].工业水处
理,2002,22(9):5-8.
[6] HUBAN C M,PLOWMAN R D.Bioaugmentation:Put microbes to
work[J].Chemical Engineering,1997,104(3):74-84.
[7] 姜梅,牛世全,展惠英，等.氯酚类化合物的微生物降解研究进展[J].应用生态学报,2003,14(6):1003-1006.
[8] 陈勇生,庄源益,戴树桂，等.2,4—二氯酚降解菌的分离及其特性[J].环境科学学报,1999,19(1)：28-32.
[9] PARK J H,ZHAO X,VOICE T parison of biodegradation kinetic para meters for naphthalene in batch and sand colu mn systems by Pseudomonas putida[J].Envirom Progr,2001,20(2)：93-102.
[10] OMEGA-CALVO J J,FESCH C,HARMS H.Biodegradation of sorbed 2,4-dinitrotoluene in a clay rich,aggregated porous medium[J].Enviran Sci Technol,1999,33：3737-3742.
[11] TROS M E,SCHRAA G,ZEHNDER A I B,et al.Transformation of low concentrations of 3-chlorobenzoate by Pseudomonas sp.strain B13：Kinetics and residual concentrations[J].Appl Environ Microbial,1996,62：437.
[12] ZHAO J S,SINGH A,HUANG X D,et a1.Biotransformation of bydroxylaminobenzene and aminoprenol by Pseudomonas putida2NP8 cells grown in the presence of 3-nitrophenol[J].Appl Environ Microbiol,2000,66：2336-2342.
[13] ARMENANTE P M,PAL N,LEWANDOWSHI B.Role of mycelium and extracellular protein in the biodegradation of 2,4,6-trichlorophenol by Phanerochaete chrysosporium[J].Appl Environ Microbiol,1994,66：1711.
[14] HARAYAMA S,TIMMIS K N.Metal ions in biological systems[M].New York:Marcel Dekker Inc,1992：99-156.
[15] ARAD H T，OHIS H I,CHANG M Y,et al.Arrangement and regulation of the genes for meta-pathway enzymes required for degradation of phenol in Comamonas testosteroni TA441[J].Microbiology，2000,146:707-715. [16] 王一惠.微生物降解苯酚的研究进展及其工程菌的应用前景[J]高技术通
讯,2001,12：98-101.
[17] 向述荣,林敏.苯酚的生物降解基因组成及其调控机制[J].微生物学
杂,2001,21(3)：48-53.
[18] 戴树桂,庄源益,陈勇生，等.两株假单胞菌中二氯酚降解酶活性及其定域研究.
环境科学学报,1996,16(2):173～178.
[19] 沈锡辉,刘志培,王保军，等.苯酚降解菌红球菌PNAN5菌株(Rhodococcus sp.strain PNAN5)的分离鉴定、降解特性及其开环双加氧酶性质研究[J].环境科学学报,2004,24(3)：482-486.
[20] 刘慧,杨柳燕,肖琳，等.酵母菌降解苯酚同时生产单细胞蛋白[J].农业环境科学学报,2004,23(4):810-813.
[21] 宋波,邓晓皋.苯酚降解菌的分离及培养特性研究[J].生物技术,2002,12(6)：15-16.
[22] 向述荣,林敏.假单胞菌phe n8的降解特性及其缺失突变株的筛选[J].高技术通讯,2001,11：20.
[23] 陈明,张维,徐玉泉等.醋酸不动杆菌PHEA-2对苯酚的降解特性研究[J].中国环境科学,2001,21(3)：226-229.
[24] 任源,慎义勇,韦朝海.驯化筛选微生物对油制气废水的降解特性[J].环境科学,2002,23(5)：76.
[25] 钟文辉,孙明,何国庆，等.降解2,4—二氯酚微生物的分离及其2 ，4—二氯酚经化酶基因的克隆和表达[J].生物工程学报,2004,20(3)：209-214.
[26] 黄俊,余刚,成捷等.白腐真菌生物降解五氯苯酚的动力学研究[J].农业环境科学学报,2004,23(1):167-169.
[27] 宋建华,宋冬林,陈涛，等.五氯酚(PCP)高效降解菌Pseudomonas sp.CS5的研究[J].应用与环境生物学报,2000,6(6)：586-592
[28] 刘和,王晓云,陈英旭.固定化微生物技术处理含酚废水[J].中国给水排
水,2003(5): 53-55.
[29] 孙艳,李京,谭立扬.一种耐酚菌种及其固定化细胞降解含酚废水性能的比较研究[J].环境科学研究,1999,12(1): 1-5.
[30] ANGELA M.Continuous degradation of phenol at low concentration using immobilized Pseudomonas putida[J].Enzyme and Mcrobial Technology， 1999 ,25 :530-536.
[31] 卞华松,张仲燕.冷冻固定化优势菌群处理含甲醛苯酚废水[J].环境科
学,1998,3(19):39-42.
[32] 王翠红,辛晓芸,徐建红,田智刚.固定化藻菌系统处理含酚废水[J].水处理技术,2000,26(4):236.
[33] KAI C L,TAI S C.Immobilixed cell membrane bioreactor for high strengh phenol wastewater[J].Journal of Environmental Engineering,2000,126:75-79
[34] 李小明,杨朝晖,李海英等.固定化厌氧微生物处理含五氯酚废水[J].湖南大学学报(自然科学版),2001,28(2):95-100(in Chinese).
[35] PUHAKKA J A.Aerobic fluidized bed treatment of polychlorinated phenolic wood preservative constitutents[J].War Res,1992,26:765. [36] GARDIN H,LEBEAULT J M,PAUSS A.Degradation of 2 ,4 ,6-Trichlorophenol ( 2，4，6—TCP) by Co-Immobilization of Anaerobic and Aerobic Microbial Communities in an Upflow Reactor under Air_Linited Conditions[J].Appl Microbiol Biotechnol,2001,56(3 ,4):524-530.
[37] LUIS G T.Production and characterization of a Caalginate biocatalyst for removal of phenol and chlorophenols from wastewaters[J].Process Biochemistry,1998，33(6):625-634.
【责任编辑黄玉萍】。