姜黄素对过度训练大鼠脾脏炎症反应的调控作用及其机制

姜黄素对过度训练大鼠脾脏炎症反应的调控作用及其机制
王　品１，曹建民２，胡　戈３，周海涛４，５△
，张　静４，５，郭　娴２，牛衍龙６，程鑫云４，李嘉蓓４
（１．北京物资学院，北京１０１１４９；２．北京体育大学，北京１０００８４；３．常州大学，江苏常州２１３１６４；４．北京联合大学，北京１００１０１；
５．北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京１００１９１；６．赣南医学院，江西赣州３４１０００）
【摘要】　目的：研究姜黄素调控Ｔｏｌｌ 样受体４（ＴＬＲ４） ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶（ｐ３８ＭＡＰＫ）／核因子κＢ（ＮＦ κ
Ｂ）信号通路缓解过度训练大鼠脾脏炎症反应的作用及其机制。

方法：７周龄ＳＰＦ级雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠分为安静对照组（Ｃ组，ｎ＝１２）、过度训练模型组（ＯＭ组，ｎ＝１１）、姜黄素＋模型组（ＣＯＭ组，ｎ＝１４）。

Ｃ组不进行任何运动干预，ＯＭ和ＣＯＭ组进行８周递增负荷游泳训练。

训练期间，ＣＯＭ组以２００ｍｇ／（ｋｇ·ｄ）、５ｍｌ／ｋｇ姜黄素进行灌胃，其他组灌胃等体积０．５％羧甲基纤维素纳助溶剂。

末次训练后２４ｈ，称重计算脾脏指数，光镜观察脾脏组织病理学改变，取血液、脾脏组织检测相关生化指标。

结果：８周递增负荷游泳训练后，光镜下Ｃ组大鼠脾脏组织结构正常；ＯＭ组较Ｃ组脾脏指数极显著降低（Ｐ＜０．０１），并出现典型炎症病理变化；ＣＯＭ组较ＯＭ组脾脏指数显著升高（Ｐ＜０．０５），且炎症病理变化有所改善。

与Ｃ组比较，ＯＭ组血清皮质酮（Ｃｏｒ）、ＮＦ κＢ、肿瘤坏死因子 α（ＴＮＦ α）、白细胞介素 ６（ＩＬ ６）水平和脾脏单核细胞表面ＴＬＲ４表达率、ＴＮＦ α、ＩＬ ６水平均升高（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），脾脏ｐ３８ＭＡＰＫ、磷酸化ｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ）和ＮＦ κＢ蛋白质表达水平均增强（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）；血清睾酮（Ｔ）、血清和脾脏白细胞介素 １０（ＩＬ １０）水平降低（Ｐ＜０．０１）。

与ＯＭ组比较，ＣＯＭ组血清Ｃｏｒ、ＮＦ κＢ、ＴＮＦ α、ＩＬ ６水平和脾脏单核细胞表面ＴＬＲ４表达率、ＴＮＦ α、ＩＬ ６水平均降低（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），脾脏ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ和ＮＦ κＢ蛋白质表达水平均降低（Ｐ＜０．０５）；血清Ｔ、血清和脾脏ＩＬ １０水平升高（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）。

组间Ｔ／Ｃｏｒ比值变化趋势与Ｔ变化相一致。

结论：８周递增负荷游泳训练引发大鼠过度训练，脾脏组织炎症反应加剧，出现炎症病理变化。

训练期间补充姜黄素可以通过下调ＴＬＲ４ ｐ３８ＭＡＰＫ／ＮＦ κＢ信号通路相关蛋白质表达，维护促炎／抑炎因子间动态平衡，保护脾脏。

【关键词】　姜黄素；过度训练；炎症；大鼠；脾
【中图分类号】Ｇ８０４．７ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１０００ ６８３４（２０２１）０３ ２８１ ００６【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．６０７５．２０２１．０２２
Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆｃｕｒｃｕｍｉｎｏｎｓｐｌｅｎｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ
ｉｎｏｖｅｒｔｒａｉｎｉｎｇｒａｔｓａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ＷＡＮＧＰｉｎ１，ＣＡＯＪｉａｎ ｍｉｎ２，ＨＵＧｅ３，ＺＨＯＵＨａｉ ｔａｏ４，５△
，ＺＨＡＮＧＪｉｎｇ４，５，ＧＵＯＸｉａｎ２，ＮＩＵＹａｎ ｌｏｎｇ６，
ＣＨＥＮＧＸｉｎ ｙｕｎ４，ＬＩＪｉａ ｂｅｉ
４
（１．ＢｅｉｊｉｎｇＷｕｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０１１４９；２．ＢｅｉｊｉｎｇＳｐｏｒｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８４；３．ＣｈａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ２１３１６４；４．ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１０１；５．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏａｃｔｉｖｅＳｕｂｓｔａｎｃｅｓａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＦｏｏｄｓ，ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９１；６．ＧａｎｎａｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇａｎｚｈｏｕ３４１０００，Ｃｈｉｎａ）
【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｕｒｃｕｍｉｎｏｎｓｐｌｅｎｉｃｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎｏｖｅｒｔｒａｉｎｉｎｇｒａｔｓｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｏｌｌ ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４（ＴＬＲ４） ｐ３８ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ（ｐ３８ＭＡＰＫ）／ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａＢ（ＮＦ κＢ）ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＭａｌｅＷｉｓｔａｒｒａｔｓｏｆ７ ｗｅｅｋｏｌｄｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｃｇｒｏｕｐ，１２），ｏｖｅｒｔｒａｉｎｉｎｇｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ（ＯＭｇｒｏｕｐ，１１），ｃｕｒｃｕｍｉｎ＋ｏｖｅｒｔｒａｉｎｉｎｇｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ（ＣＯＭｇｒｏｕｐ，１４）．ＣＧｒｏｕｐｄｉｄｎｏｔｕｎｄｅｒｇｏａｎｙｅｘｅｒｃｉｓｅｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．ＯＭａｎｄＣＯＭｇｒｏｕｐｕｎ ｄｅｒｗｅｎｔ８ ｗｅｅｋｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌｌｏａｄｓｗｉｍｍｉｎｇｔｒａｉｎｉｎｇ．Ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｔｒａｉｎｉｎｇ，ｒａｔｓｉｎｔｈｅＣＯＭｇｒｏｕｐｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ２００ｍｇ／（ｋｇ·ｄ）ｃｕｒｃｕｍｉｎｉｎｔｈｅｖｏｌｕｍｅａｓ５ｍｌ／ｋｇ，ａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈａｎｅｑｕａｌｖｏｌｕｍｅｏｆ０．５％ｓｏｄｉｕｍｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．２４ｈｏｕｒｓａｆｔｅｒｔｈｅｌａｓｔｔｒａｉｎｉｎｇ，ｔｈｅｓｐｌｅｅｎｉｎｄｅｘｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄｂｙｗｅｉｇｈｉｎｇ，ｔｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅｓｐｌｅｅｎｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｌｉｇｈｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ａｎｄｔｈｅｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｎｄｉｃａｔｏｒｓｏｆｂｌｏｏｄａｎｄｓｐｌｅｅｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａｆｔｅｒ８ ｗｅｅｋｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌｌｏａｄｓｗｉｍｍｉｎｇｔｒａｉｎｉｎｇ，ｔｈｅｓｐｌｅｎｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎＣｇｒｏｕｐｗａｓｎｏｒｍａｌｕｎｄｅｒｌｉｇｈｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ｔｈｅｓｐｌｅｅｎｉｎｄｅｘｏｆＯＭｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆＣｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）ａｎｄｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｗｅｒｅｏｂｖｉｏｕｓ；ｔｈｅｓｐｌｅｅｎｉｎｄｅｘｏｆＣＯＭｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆＯＭｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）ａｎｄｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｗｅｒｅａｌｌｅｖｉａｔｅｄ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣｇｒｏｕｐ，ｉｎＯＭｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｓｅｒｕｍｌｅｖｅｌｓｏｆｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ（Ｃｏｒ），ＮＦ κＢ，ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ（ＴＮＦ α），ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６（ＩＬ ６）ａｎｄＴＬＲ４ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｅｏｎｓｐｌｅｎｉｃｍｏｎｏｃｙｔｅｓｓｕｒｆａｃｅ，ｓｐｌｅｎｉｃＴＮＦ α，ＩＬ ６ｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５ｏｒＰ＜０．０１），ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｐ３８ＭＡＰＫ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｐ３８ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ（ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ）ａｎｄＮＦ κ
Ｂｉｎｓｐｌｅｅｎｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５ｏｒＰ＜１
８２中国应用生理学杂志，２０２１，３７（３）
０．０１）；ｓｅｒｕｍｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（Ｔ），ｓｅｒｕｍａｎｄｓｐｌｅｎｉｃｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０（ＩＬ １０）ｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０１）．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＯＭｇｒｏｕｐ，ｉｎＣＯＭｇｒｏｕｐ，ｓｅｒｕｍｌｅｖｅｌｓｏｆＣｏｒ，ＮＦ κＢ，ＴＮＦ α，ＩＬ ６ａｎｄＴＬＲ４ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｅｏｎｓｐｌｅｎｉｃｍｏｎｏｃｙｔｅｓｓｕｒｆａｃｅ，ｓｐｌｅｎｉｃＴＮＦ α，ＩＬ ６ｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５ｏｒＰ＜０．０１），ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｐ３８ＭＡＰＫ，ｐ ｐ３８ＭＡＰＫａｎｄＮＦ κＢｉｎｓｐｌｅｅｎｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）；ｓｅｒｕｍＴ，ｓｅｒｕｍａｎｄｓｐｌｅｎｉｃＩＬ １０ｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｔｒｅｎｄｏｆＴ／Ｃｏｒｒａｔｉｏｂｅｔｗｅｅｎｇｒｏｕｐｓｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅｃｈａｎｇｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ８ ｗｅｅｋｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌｌｏａｄｓｗｉｍｍｉｎｇｔｒａｉｎｉｎｇａｇｇｒａｖａｔｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｏｆｓｐｌｅｅｎｉｎｒａｔｓ，ｌｅｄｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｈａｎｇｅｓ．Ｃｕｒｃｕｍｉｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｔｒａｉｎｉｎｇｃａｎｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＴＬＲ４ ｐ３８ＭＡＰＫ／ＮＦ κ
Ｂｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｔｈｅｒｅｂｙｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇａｄｙｎａｍｉｃｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍｂｅｔｗｅｅｎｐｒｏ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ／ａｎｔｉ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏ ｋｉｎｅｓ，ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅｓｐｌｅｅｎ．
【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】　ｃｕｒｃｕｍｉｎ；　ｏｖｅｒｔｒａｉｎｉｎｇ；　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；　ｒａｔ；　ｓｐｌｅｅｎ
【基金项目】北京市朝阳区协同创新项目（ＣＹＸＣ１８１７）；北京市
高等学校高水平人才交叉培养“实培计划”项目；北京联合大学科研项目（ＺＫ７０２０２００５）；北京联合大学“启明星”大学生科技创新创业项目（２０２０１１４１７ＳＪ１３６）【收稿日期】２０２０ ０４ ２２【修回日期】２０２１ ０１ ０７　△【通讯作者】Ｔｅｌ：１３６１１３８３０４０；Ｅ ｍａｉｌ：ｚｓｅｔｔｌｅ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
Ｔｏｌｌ 样受体４（ｔｏｌｌ ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４，ＴＬＲ４）作为炎症反应过程中重要上游启动蛋白，广泛表达于多种免疫细胞表面。

当免疫细胞受到应激刺激时，ＴＬＲ４可以通过激活ＴＬＲ４ ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶（ｐ３８ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ｐ３８ＭＡＰＫ）／核因子κＢ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａＢ，ＮＦ κ
Ｂ）信号通路，从基因水平诱导多种促炎细胞因子表达，引发炎症反
应［１ ２］。

脾脏作为人体最大的免疫器官，是免疫应答
发生的重要基地，在细胞免疫和体液免疫中均发挥着不可替代的作用。

长时程、大强度运动极易引发机体过度疲劳，当疲劳无法得到有效恢复时，机体可能发生过度训练综合症。

研究表明过度训练不仅会影响运动能力，诱发运动性免疫抑制，还会引发运动性脾脏功能障碍和结构损伤，炎症反应是其中主要
影响因素［３ ４］。

姜黄素是姜黄中提取的一种植物多
酚，具有抗氧化、抗肿瘤、保护神经等多种药理学作用，亦可通过有效抑制ＴＬＲ４ ＭＡＰＫ／ＮＦ κＢ信号通路激活，减少肿瘤坏死因子 α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ，ＴＮＦ α
）及白细胞介素 ６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６，ＩＬ ６）等促炎因子的表达，发挥抑炎作用［５］。

本课题组前期研究［６］亦发现姜黄素可通过抑制炎症，延缓长时
程、大强度运动所致运动性脏器损伤，保护脏器结构和功能正常。

本实验结合前期研究，通过观察脾脏组织病理学改变，计算脾脏指数，结合脾脏组织相关信号通路蛋白表达水平及炎症指标变化，探讨姜黄素通过调控ＴＬＲ４ ｐ３８ＭＡＰＫ／ＮＦ κＢ信号通路，缓解过度训练所致大鼠脾脏炎症反应，保护脾脏的作用机制。

１　材料与方法
１．１　实验动物与分组
６３只７周龄雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，ＳＰＦ级，体重（２１８．４±１０．７）ｇ，北京大学医学部实验动物科学部提供，生产合格证编号：ＳＣＸＫ（京）２０１６ ００１０。

北京体育大学ＳＰＦ级动物实验室正常昼夜节律饲养，温度（２２±２）℃，相对湿度６５％±１０％。

４ｄ适应性饲养后，以２０ｍｉｎ／ｄ强度进行３ｄ适应性游泳训练，３只大鼠因无法完成训练，剔除后将剩余大鼠随机
分为安静对照组（
Ｃ组，ｎ＝１２）、过度训练模型组（ＯＭ组，ｎ＝２４）和姜黄素＋模型组（ＣＯＭ组，ｎ＝２４
）。

１．２　训练方案与干预
Ｃ组不进行运动干预。

ＯＭ、ＣＯＭ组大鼠采用８周递增负荷游泳训练方案建立过度训练动物模型，
方案［７］
见图１。

训练过程中，若大鼠下沉不能自主
上浮，计时１０ｓ后迅速托出水面，休息５～１０ｍｉｎ后继续训练直至完成训练计划。

姜黄素购自陕西源泰生物科技公司，纯度≥９９％，批号：１７０１２５７１。

使用０．５％羧甲基纤维素纳作为助溶剂，配制姜黄素混悬液，４℃存放备用。

根
据文献［６］
及预实验结果，ＣＯＭ组大鼠姜黄素干预剂
量为２００ｍｇ／ｋｇ，灌胃体积为５ｍｌ／ｋｇ；其他组灌胃等体积０．５％羧甲基纤维素纳助溶剂。

训练期间每日灌胃１次，在训练前１ｈ
进行。

Ｆｉｇ．１　Ｓｗｉｍｍｉｎｇｔｒａｉｎｉｎｇｐｒｏｇｒａｍｏｆｒａｔｓ
ｓｗｉｍｍｉｎｇｔｉｍｅ（ｍｉｎ）×ｌｏａｄｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｔｈｅｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ
（ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ％）×ｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｔｒａｉｎｉｎｇ
１．３　实验动物取材
受训练量、训练强度、运动疲劳恢复等因素影响，大鼠在游泳训练中易出现意外死亡现象。

ＯＭ、ＣＯＭ组取材前分别剩余１１只和１４只大鼠。

末次
２８２ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０２１，３７（３）
训练结束后２４ｈ，大鼠以乙醚麻醉后称重，颈总动脉取血，４℃离心１０ｍｉｎ，３０００ｒ／ｍｉｎ，分离血清冻存待测血清ＮＦ κＢ、ＴＮＦ α、ＩＬ ６、白细胞介素 １０（ｉｎｔｅｒ ｌｅｕｋｉｎ １０，ＩＬ １０）浓度。

取出脾脏后，小心剥离周围脂肪组织，在经过预冷的生理盐水中洗净血污，滤纸吸取多余液体后称重、记录并计算脾脏指数。

切取１ｃｍ×０．５ｃｍ×０．２ｃｍ脾脏组织浸入４％多聚甲醛常温固定待后期苏木素 伊红（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ｅｏｓｉｎ，ＨＥ）染色后光镜下观察脾脏组病理变化及检测脾脏组织ｐ３８ＭＡＰＫ、磷酸化ｐ３８ＭＡＰＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄｐ３８ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｃｌｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ）和ＮＦ κＢ蛋白质表达情况；另取０．３ｇ左右脾脏组织，准确称量重量后按照组织块重量Ｗ（ｇ）／匀浆介质Ｖ（ｍｌ）为１／９的比例加入ＰＢＳ缓冲液，在冰上充分研磨后进行超声破碎，５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清待测脾脏组织ＴＮＦ α、ＩＬ ６、ＩＬ １０浓度；另取部分脾脏放入ＰＢＳ缓冲液中低温保存，待测脾脏单核细胞表面ＴＬＲ４表达率。

１．４　指标测试方法
按照试剂盒说明书对各指标进行测试和计算。

主要仪器包括ＲＭ２０１６病理切片机（德国Ｌｅｉｃａ公司），ＢＸ５１Ｆ３２Ｈ０１光学显微镜（日本ＯＬＹＭＰＵＳ公司），ＰａｎｎｏｒａｍｉｃＭＩＤＩ全自动数字切片扫描系统（匈牙利３ＤＨＩＳＴＥＣＨ公司），ＷｅｌｌｓｃａｎＭＫ３酶标仪（芬兰ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ公司），ＣｙｔｏＦＬＥＸ流式细胞仪（美国ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ公司），ＮＲ Ｂ１７ＣＣ超低温冰箱（日本Ｐａｎａｓｏｎｉｃ公司），ＤＹ８９ Ⅱ电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）等。

１．４．１　脾脏指数计算［４］　脾脏指数＝脾脏重量（ｍｇ）／体重（ｇ）×１００％
１．４．２　脾脏病理变化评价　将固定好的脾脏组织取出，经梯度酒精脱水后进行透明处理，浸蜡包埋，冷却后以４μｍ厚度进行切片。

ＨＥ染色，４００倍光镜下观察脾脏组织病理变化。

１．４．３　蛋白免疫组化分析　采用免疫组化法检测脾脏ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ和ＮＦ κＢ蛋白质表达情况。

石蜡切片经梯度酒精脱蜡后进行抗原修复，加入３％过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，血清封闭后加入一抗，４℃孵育过夜，加入对应二抗，室温孵育后进行二氨基联苯胺显色，复染细胞核，脱水封片。

采用数字切片扫描系统对整张切片进行全视野数字扫描，细胞核颜色为深棕色、棕黄色、浅黄色和蓝色分别判定为强阳性、中度阳性、弱阳性和阴性。

应用公式计算Ｈ ｓｃｏｒｅ进行组间分析。

Ｈ ｓｃｏｒｅ＝（弱阳性细胞密度×１）＋（中阳性细胞密度×２）＋（强阳性细胞密度×３）。

抗体由美国Ｓｉｇｍａ公司提供。

１．４．４　其他指标测试方法　采用放射免疫法测定血清睾酮（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ，Ｔ）和皮质酮（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ，Ｃｏｒ）；采用流式细胞术检测脾脏单核细胞表面ＴＬＲ４表达率；酶联免疫吸附法检测血清ＮＦ κＢ、血清及脾脏组织ＴＮＦ α、ＩＬ ６、ＩＬ １０浓度。

以上试剂盒由北京华英生物技术研究所提供。

１．５　统计学处理
所得数据以均数±标准差（珋ｘ±ｓ）表示，使用ＳＰＳＳ２２．０软件进行统计分析。

采用Ｓｈａｐｉｒｏ Ｗｉｌｋ检验对数据进行正态分布检验，组间比较采用单因素方差分析（ｏｎｅ ｗａｙＡＮＯＶＡ），方差齐时采用ＬＳＤ法，方差不齐采用Ｔａｍｈａｎｅ法。

２　结果
２．１　各组大鼠血清睾酮／皮质酮及脾脏指数血清Ｔ，与Ｃ组相比，ＯＭ组极显著降低（Ｐ＜０．０１）；与ＯＭ组相比，ＣＯＭ组极显著升高（Ｐ＜０．０１）。

血清Ｃｏｒ，与Ｃ组相比，ＯＭ组极显著升高（Ｐ＜０．０１）；与ＯＭ组相比，ＣＯＭ组极显著降低（Ｐ＜０．０１）。

组间Ｔ／Ｃｏｒ比值变化与Ｔ变化趋势一致。

脾脏指数，与Ｃ组相比，ＯＭ组极显著降低（Ｐ＜０．０１）；与ＯＭ组相比，ＣＯＭ组显著升高（Ｐ＜０．０５，表１）。

２．２　各组大鼠脾脏组织形态
光镜下观察，大鼠脾脏组织病理学诊断结果显示（图２），Ｃ组大鼠脾脏组织形态正常，被膜、小梁、白髓和红髓结构清晰，脾小体未见增大，生发中心明显，脾窦内壁光滑，未见充血和淋巴细胞。

ＯＭ组大鼠脾脏组织形态明显改变，红髓和白髓交界处淋巴细胞数量增多，脾小体增大，出现多个生发中心，脾窦内皮细胞肿胀，窦腔充血且可见淋巴细胞增多。

Ｔａｂ．１　Ｓｅｒｕｍｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ／ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅｌｅｖｅｌｓａｎｄｓｐｌｅｅｎｉｎｄｅｘｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（珋ｘ±ｓ）
ＧｒｏｕｐｎＴ（ｎｇ／ｍｌ）Ｃｏｒ（ｎｇ／ｍｌ）Ｔ／Ｃｏｒ（１０ ２）ＳｐｌｅｅｎｉｎｄｅｘＣ１２１．８２±０．７１２３．８１±３．９１８．３４±４．３７１．９２±０．２４ＯＭ１１０．５０±０．１２ ４５．９５±６．９３ １．１４±０．４４ １．５０±０．２３ ＣＯＭ１４１．２２±０．６６＃＃３０．１１±８．４１＃＃４．４０±４．２６＃＃１．８４±０．２７＃
Ｃ：Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；ＯＭ：Ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｅｘｅｒｃｉｓｅｇｒｏｕｐ；ＣＯＭ：Ｃｕｒｃｕｍｉｎ＋ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｅｘｅｒｃｉｓｅｇｒｏｕｐ
Ｐ＜０．０１ｖｓＣｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓＯＭｇｒｏｕｐ
３８２
中国应用生理学杂志，２０２１，３７（３）
ＣＯＭ组大鼠脾脏组织形态较ＯＭ组明显改善，仅可
见窦腔轻度充血及少量淋巴细胞分布。

Ｆｉｇ．２　Ｓｐｌｅｅｎｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（ＨＥ×４００）
２．３　各组大鼠血清炎症因子水平
血清促炎指标ＮＦ κＢ、ＴＮＦ α和ＩＬ ６，与Ｃ组相比，ＯＭ组均极显著升高（Ｐ＜０．０１）；与ＯＭ组相比，ＣＯＭ组均显著降低（Ｐ＜０．０５）。

血清抑炎指标ＩＬ １０
，与Ｃ组相比，ＯＭ组极显著降低（Ｐ＜０．０１）；与ＯＭ组相比，ＣＯＭ组显著升高（Ｐ＜０．０５，表２）。

Ｔａｂ．２　Ｓｅｒｕｍｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓｌｅｖｅｌｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（ｎｇ／Ｌ，珋
ｘ±ｓ）ＧｒｏｕｐｎＮＦ κＢＴＮＦ αＩＬ ６ＩＬ １０Ｃ１２１．１１±０．３０
６．８７±１．７８
２０．１１±７．３８
４３０．３１±９．５４
ＯＭ１１１．８４±０．２１
２１．４０±９．３３
６１．２４±１１．９３
２８１．４３±１２．５３
ＣＯＭ
１４
１．３５±０．２５
＃９．３８±３．０５
＃３９．６８±６．９６
＃３６３．３５±９．２６
＃ Ｃ：Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；ＯＭ：Ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｅｘｅｒｃｉｓｅｇｒｏｕｐ；ＣＯＭ：Ｃｕｒｃｕｍｉｎ＋ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｅｘｅｒｃｉｓｅｇｒｏｕｐ；ＮＦ κＢ：ＮｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ；ＴＮＦ α：Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ α
；ＩＬ ６：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６；ＩＬ １０：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０
Ｐ＜０．０１ｖｓＣｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０．０５ｖｓＯＭｇｒｏｕｐ
２．４　各组大鼠脾脏单核细胞ＴＬＲ４表达率及炎症因子水平
脾脏单核细胞ＴＬＲ４表达率、ＴＮＦ α和ＩＬ ６，与Ｃ组相比，ＯＭ组均极显著升高（Ｐ＜０．０１）；与ＯＭ组
相比，ＣＯＭ组均显著降低（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）。

脾脏ＩＬ １０，与Ｃ组相比，ＯＭ组极显著降低（Ｐ＜０．０１）；与ＯＭ组相比，ＣＯＭ组极显著升高（Ｐ＜０．０１，表３）
Ｔａｂ．３　ＴＬＲ４ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｅｓｏｎｓｐｌｅｎｉｃｍｏｎｏｃｙｔｅｓｕｒｆａｃｅａｎｄｌｅｖｅｌｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｎｓｐｌｅｅｎｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（珋
ｘ±ｓ）ＧｒｏｕｐｎＴＬＲ４ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
（％）ＴＮＦ α
（ｐｇ／ｍｇ）ＩＬ ６
（ｐｇ／ｍｇ）ＩＬ １０
（ｐｇ／ｍｇ）Ｃ１２２４．８１±０．７６
６．０２±０．１６
１７．１７±１．５９
２．２０±０．０８
ＯＭ１１２９．１４±１．０６ ７．０７±０．３４ ２３．９３±２．５０ １．５５±０．１３ ＣＯＭ
１４
２６．７１±０．８７
＃６．３１±０．２０
＃＃１９．０９±２．０９
＃１．９１±０．１２
＃＃ Ｃ：Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；ＯＭ：Ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｅｘｅｒｃｉｓｅｇｒｏｕｐ；ＣＯＭ：Ｃｕｒｃｕｍｉｎ＋ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｅｘｅｒｃｉｓｅｇｒｏｕｐ；ＴＬＲ４：Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４；ＴＮＦ α：Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ α
；ＩＬ ６：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６；ＩＬ １０：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０
Ｐ＜０．０１ｖｓＣｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓＯＭｇｒｏｕｐ
２．５　各组大鼠脾脏ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ和ＮＦ κ
Ｂ蛋白质表达水平脾脏组织ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ和ＮＦ κＢ蛋白质表达水平，与Ｃ组相比，ＯＭ组均显著上调（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）；与ＯＭ组相比，ＣＯＭ组均显著下调（Ｐ＜０．０５，表４，图３）。

Ｔａｂ．４　Ｈ ｓｃｏｒｅｏｆｐ３８ＭＡＰＫ，ｐ ｐ３８ＭＡＰＫａｎｄＮＦ κ
Ｂｉｎｓｐｌｅｅｎｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐ（珋
ｘ±ｓ）Ｇｒｏｕｐｎ
ｐ３８ＭＡＰＫ
ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ
ＮＦ κＢＣ１２９４．６１±１８．６５１４．６２±４．５９７６．８５±１６．８６
ＯＭ１１１５５．０５±３１．５７ ４０．０５±１２．０９ １３６．１２±２７．４７
ＣＯＭ
１４１０１．６６±２４．８８＃
１７．９２±５．５２
＃
８８．７６±２３．５８
＃
Ｃ：Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；ＯＭ：Ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｅｘｅｒｃｉｓｅｇｒｏｕｐ；ＣＯＭ：Ｃｕｒｃｕｍｉｎ＋ｈｉｇｈ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｅｘｅｒｃｉｓｅｇｒｏｕｐ；ｐ３８ＭＡＰＫ：ｐ３８ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ；ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ：ｐｈｏｓｐｈｏ ｒｙｌａｔｅｄｐ３８ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ；ＮＦ κＢ：ＮｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ
Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１ｖｓＣｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０．０５ｖｓＯＭｇｒｏｕ
ｐ
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｐ３８ＭＡＰＫ，ｐ ｐ３８ＭＡＰＫａｎｄＮＦ
κ
ＢｉｎｓｐｌｅｅｎｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐＴｈｅｃｏｌｏｒｏｆｎｕｃｌｅｉｗａｓｄａｒｋｂｒｏｗｎ，ｂｒｏｗｎｉｓｈｙｅｌｌｏｗ，ｌｉｇｈｔｙｅｌｌｏｗａｎｄｂｌｕｅ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｊｕｄｇｅｄａｓｓｔｒｏｎｇｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｍｏｄｅｒａｔｅｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｗｅａｋｐｏｓｉｔｉｖｅａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅ
，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ３　讨论
脾脏作为最大的淋巴器官，在局部和全身免疫反应调节中发挥重要整合作用。

同时脾脏也是血液循环系统主要的过滤器。

过度训练可破坏促炎／抑炎因子间的动态平衡，降低人体免疫防御活性，诱发
４８２ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０２１，３７（３）
脾脏功能障碍和结构损伤［３ ４］。

血清Ｔ／Ｃｏｒ比值在体育科学领域是判断过度训练的常用指标［８］。

脾脏指数则可间接反映脾脏功能［４］。

本研究中与Ｃ组相比，ＯＭ组大鼠血清Ｔ水平极显著降低，Ｃｏｒ水平极显著升高，Ｔ／Ｃｏｒ比值极显著降低，同时脾脏指数出现极显著降低，ＨＥ染色后光镜下观察发现脾脏组织出现典型慢性炎症病理变化，说明本研究通过８周递增负荷游泳训练，成功建立过度训练动物模型，并引发脾脏结构／功能异常。

ＴＬＲ４ ｐ３８ＭＡＰＫ／ＮＦ κＢ信号通路与炎症调节和控制机制密切相关。

ＴＬＲ４作为跨膜蛋白Ｔｏｌｌ样受体家族的成员，其激活具有双向作用。

适度表达的ＴＬＲ４可以启动机体防御机制，在自身免疫中发挥关键作用；而过量运动诱发ＴＬＲ４过度表达，又会成为炎症性疾病发展的助推因素［９］。

ｐ３８ＭＡＰＫ通路可对多种应激刺激产生广泛应答，在炎症反应中发挥关键作用，是多种炎症疾病的治疗靶点。

ＴＬＲ４［１０］和运动应激［１１］均可通过增加ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ表达，诱导炎症反应。

ＮＦ κＢ在哺乳动物先天免疫反应和慢性炎症中发挥关键作用，也是ＴＬＲ４诱导炎症反应的重要靶点。

ＴＬＲ４表达上调将促使ＮＦ κＢ与ＮＦ κＢ抑制蛋白（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆＮＦ κＢ，ＩκＢ）解离，转位至胞核内与ＤＮＡ特定序列结合，调节炎症因子基因转录，参与炎症发展与转归等生理过程［１］。

而活化的ｐ３８ＭＡＰＫ也可通过磷酸化修饰或促进炎症因子表达激活ＮＦ κＢ，后者又能够通过ＴＮＦ α、ＩＬ ６等炎性产物进一步激活ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路［１２］。

本研究中，与Ｃ组相比，ＯＭ组大鼠脾脏单核细胞表面ＴＬＲ４表达率、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ以及ＮＦ κＢ蛋白质表达水平均显著升高，同时脾脏及血清促炎因子ＴＮＦ α、ＩＬ ６水平同步显著升高，抑炎因子ＩＬ １０水平同步显著降低。

上述结果说明８周大强度游泳训练激活ＴＬＲ４ ｐ３８ＭＡＰＫ／ＮＦ κＢ信号通路，打破促炎／抑炎因子间的动态平衡，致使脾脏慢性炎症反应加剧，炎症因子释放入血，引发血清炎症水平同步升高。

姜黄素是一种食源性多酚类化合物，具有多个功能基团，可与多种分子靶标结合，发挥抑炎作用［５］。

姜黄素及其类似物可以与脂多糖竞争结合ＴＬＲ４的共受体蛋白髓样分化蛋白２，抑制两者形成信号转导复合物，减轻ＴＬＲ４介导的炎症过程［１３］。

ｐ３８ＭＡＰＫ是姜黄素发挥抑炎作用的又一重要靶点。

Ｇｕｉｍａｒ ｅｓ等［１４］的研究中，利用大肠杆菌脂多糖建立大鼠巨噬细胞炎症模型，发现姜黄素通过阻止ｐ３８ＭＡＰＫ的磷酸化和核易位，抑制脂多糖诱导的ＴＮＦ α和ＩＬ ６表达。

Ｓｏｎｇ等［１５］的研究也认为，姜黄素的抑炎作用可归因于对ｐ３８ＭＡＰＫ磷酸化的抑制。

同时，姜黄素作为一种有效的ＮＦ κＢ抑制剂，可以通过抑制ＩκＢ磷酸化、ＩκＢ激酶活性以及ＮＦ κＢ核易位，直接发挥抑炎作用［５］。

本研究发现，ＣＯＭ组大鼠脾脏单核细胞表面ＴＬＲ４表达率、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ ｐ３８ＭＡＰＫ以及ＮＦ κＢ蛋白质表达水平较ＯＭ组均显著降低，同时伴随脾脏及血清促炎因子水平同步显著降低，抑炎因子水平同步显著升高，说明补充姜黄素可以改善ＴＬＲ４ ｐ３８ＭＡＰＫ／ＮＦ κＢ通路介导的炎症过程，调节相关炎症因子的合成与分泌，这与相关研究结果基本一致［１６ １７］。

炎症反应通常伴随巨噬细胞向Ｍ１型极化，导致促炎因子过度表达，而姜黄素可以通过抑制巨噬细胞向Ｍ１型极化，增加Ｍ２型巨噬细胞数量，直接减少促炎因子基因表达，减轻炎症反应［１８］。

ＩＬ １０作为一种有效的抑炎因子，在抑制免疫反应和预防过度炎症反应诱导的器官损害中发挥重要作用［１９］。

细胞实验证实［２０］，巨噬细胞摄取负载姜黄素的纳米颗粒后显著增加ＩＬ １０的释放。

Ｌａｒｍｏｎｉｅｒ等［２１］的研究发现，在ＩＬ １０缺陷小鼠结肠炎模型中，姜黄素对ＮＦ κＢ活性无显著影响，这提示本研究中ＣＯＭ组大鼠脾脏及血清ＩＬ １０浓度均较ＯＭ组显著升高，可能不仅是姜黄素发挥抑炎作用的结果，也是姜黄素发挥抑炎作用的中介途径之一。

上述结果结合ＣＯＭ组大鼠脾脏指数及组织病理学诊断结果的改善，充分说明在８周递增负荷游泳训练期间对大鼠进行一定剂量姜黄素干预，可以通过多靶点调控，有效恢复失衡的炎症介质网络，维护促炎／抑炎因子间的动态平衡，通过减轻过度炎症反应保护脾脏。

综上所述，８周递增负荷游泳训练引发大鼠脾脏组织炎症反应加剧，出现炎症病理变化。

训练期间补充姜黄素可以通过下调ＴＬＲ４ ｐ３８ＭＡＰＫ／ＮＦ κＢ信号通路相关蛋白质表达，维护促炎／抑炎因子间的动态平衡，保护脾脏。

本研究将为运动性炎症反应诱发脏器损伤提供实验依据，相关信号转导通路之间的交互作用有待进一步研究。

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