012大豆分离蛋白的双酶改性改善功能性的实验[1]

６
２
３
１
２
７８．５
７ ３（６０） １
３
２
９０．４
８
３
２
１
３
８５．９
９
３
３
２
１
９０．２
Ｋ１ ２５３．４ ２６２．７ ２３９．７ Ｋ２ ２６３．１ ２５８．１ ２７１．８
２５３．１ ２５３．５
∑＝７８３．０
Ｋ３ ２６６．５ ２６２．２ ２７１．５ ｋ１ ８４．５ ８７．６ ７９．９ ｋ２ ８７．７ ８６．０ ９０．６ ｋ３ ８８．８ ８７．４ ９０．５
０ 前言
大豆分离蛋白是一种蛋白纯度高、具有加工功 能性的食品添加用的中间原料。ＳＰＩ具有溶解 性、乳 化性、起泡性、保水性、保油性和黏弹性等多种功
能。但实践表明， 一种ＳＰＩ难于同时兼具有上述多 种 功能。而生产上需求的却是专项最佳功能或兼具有 几种功能平衡点的产品。因此， 要对现有的蛋白质 进行改造， 以满足人类的某种特殊要求。
食品技术
采用特定目的意义的改性技术， 就可获得较高经济 效益。ＳＰＩ经过酶法水解后， 溶解性得到了 明显的改 善， 不破坏氨基酸结构， 水解产物是小分子肽和氨 基酸， 易为人体消化、吸收， 也更适于食品加工领域 的应用。ＴＧ是 一 种 能 催 化 多 肽 或 蛋 白 质 谷 氨 酰 胺 残 基 的γ－ 羟 胺 基 团 与 许 多 伯 胺 化 合 物 之 间 产 生 酰 基 转 移反应的酶。
食品技术
大豆分离蛋白的双酶改性 改善功能性的实验
孙 焕，张春红，陈海英，连芙菲，刘长江 （沈阳农业大学食品学院， 沈阳 １１０１６１）
摘要：对大豆分离蛋白（ＳＰＩ）进行传统改性， 只可以改善一个或几个功能性， 而ＳＰＩ的溶解性和分子量
不能兼得。利用中性蛋白酶和谷氨酰胺转胺酶（ＴＧ）对大豆分离蛋白进行复合改性， 通过单因素和正交
现有的大豆蛋白质来源丰富、价格低廉， 所以
收稿日期：２００５－ ０６－ ２１ 基金项目： 辽 宁 省 科 技 厅 科 技 攻 关 项 目（２００４２０５００１）。 作者简介：孙焕（１９８０－ ）， 男， 山东莱州人， 硕士研究生， 主要从事蛋白质、酶工程方面的研究工作。
Ｎｏ． １２． ２００５ １１
图１ 酶解时间对溶解性影响的试验结果
２．１．２ 酶 解 温 度 的 影 响 控 制 酶 的 用 量 为 ３０００Ｕ／ｇ ＳＰＩ， ［ｓ］１０％ ， ｐＨ 为 ７．０， 时 间 １ｈ， 温 度 梯 度 变 化 为 ４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃。
图２ 酶解温度对溶解性影响的试验结果
由图２可知， ５０℃和６０℃的ＳＰＩ溶解度较高。随着 温度继续上升， 溶解度下降显著， 这是因为超过了 中性蛋白酶的承受温度， 从而导致酶蛋白失去活性。 ２．１．３ ｐＨ的影响 控制酶的用量为３０００Ｕ／ｇＳＰＩ， 温度 ５０℃， ［ｓ］１０％， 时间１ｈ， ｐＨ梯度变化为６．０、６．５、７．０、 ７．５、８．０， 结果见图３。
实验研究了中性蛋白酶酶解的最佳工艺条件： 温度６０℃、时间０．５ｈ、ｐＨ７．０、酶用量４０００Ｕ／ｇ， ＳＰＩ溶解
性可达９７．９％； 再经过ＴＧ改性， 所得的聚合物虽然有很大的分子 量， 还可以改善ＳＰＩ的溶解性， 并且
乳化性、发泡性均有提高。
关键词：大豆分离蛋白； 中性蛋白酶； 谷氨酰胺转胺酶； 溶解性
大 豆 分 离 蛋 白 的 主 要 成 分 为 ７Ｓ和 １１Ｓ球 蛋 白 。 因 而， 大豆分离蛋白的溶解度很低， 这样就限制了大 豆分离蛋白的使用范围， 故改善大豆分离蛋白的溶 解性， 成了大豆分离蛋白实际应用亟需解决的问题。
１ 材料与方法
１．１ 材料和仪器 大豆分离蛋白（蛋白质含量≥９０％）： 哈 尔 滨 黎 明
实验
号 温度（℃） 时间（ｈ） ｐＨ
Ａ
Ｂ
Ｃ
溶解性 酶浓度（Ｕ／ｇＳＰＩ） （％）
Ｄ
１ １（４０） １（０．５） １（６．５） １（２０００）
７５．３
２
１
２（１） ２（７．０） ２（３０００）
８４．６
３
１ ３（１．５） ３（７．５） ３（４０００）
９３．５
４ ２（５０） １
２
３
９７．０
５
２
２
３
１
８７．６
食品技术
Ａ３Ｂ１Ｃ２Ｄ３， 即 最 佳 工 艺 条 件 为 反 应 温 度 ６０℃、 时 间 ０．５ｈ、 ｐＨ７．０、 酶 用 量 ４０００Ｕ／ｇ。 选 取 表 观 最 佳 组 合 与 极差分析最佳组合作进一步验证实验， 结果表明极 差 分 析 最 佳 组 合 的 酶 解 结 果（溶 解 性 为９７．９％）优 于 表 观最佳组合。
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ ： Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｎ ｓ ｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｏｌａｔｅ （Ｓ Ｐ Ｉ）， ｃａｎ ｉｍｐｒｏｖｅ ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｒ ｓ ｏｍｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓ Ｐ Ｉ， ａｎｄ ｗｅ ｃａｎ′ｔ ｈａｖｅ ｈｉｇｈ ｓ ｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｓ ｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｌｙ． Ｕｓ ｉｎｇ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓ ｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓ ｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓ ｇｌｕｔａｍｉｎａｓ ｅ ｏｎ Ｓ Ｐ Ｉ， ｔｈｒｏｕｇｈ ｏｄｄ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓ ｔｓ ａｎｄ ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ， ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓ ｉｓ ａｒｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ６０℃， ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ０．５ｈ， ｐＨ７．０， ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ４０００Ｕ／ｇ， ｔｈｅ ｓ ｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｓ Ｐ Ｉ ｃａｎ ａｃｈｉｅｖｅ ９７．９％． Ｔｈｅｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＴＧ， ｃａｎ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｈａｖｅ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ， ｂｕｔ ａｌｓ ｏ ｃａｎ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓ ｏｌｕｂｉｌｉｔｙ， ｅｍｕｌｓ ｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｆｏａｍｉｎｇ ｐｒｏ－ ｐｅｒｔｙ ｏｆ Ｓ Ｐ Ｉ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｓ ｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｏｌａｔｅ； ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓ ｅ： ｔｒａｎｓ ｇｌｕｔａｍｉｎａｓ ｅ； ｓ ｏｌｕｂｉｌｉｔｙ
２７６．４ ８４．４ ８４．５ ９２．１
Ｒ ４．３
１．６ １０．７
７．７
由表１可知， 经过中性蛋白酶酶解改性的ＳＰＩ正交 试验， 综合分析４因素３水平试验结果， 得知影响ＳＰＩ 溶解性各主要因素条件的主次关系为ｐＨ值＞酶 浓 度＞ 反应温度＞反应时间。酶解条件表观最佳组合与极差 分 析 最 佳 组 合 不 一 致 ， 前 者 为 Ａ２Ｂ２Ｃ２Ｄ２； 后 者 为
１２ Ｎｏ． １２． ２００５
和泡沫稳定性的测定： 详见参考文献［４］。 溶解度的测定： 双 缩 脲 法 。配 制１％大 豆 分 离 蛋
白水解液， 平衡４５ｍｉｎ， ３０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ， 取１ｍＬ 上 清 液 于 试 管 中 ， 加 入４ｍＬ双 缩 脲 试 剂 ， 激 烈 振 荡 １０ｍｉｎ后 ， 放 置１ｈ， 于５４０ｎｍ处 进 行 比 色 测 定 。 再 用 凯氏定氮法测得总蛋白质含量， 计算两者比值。 ２ 结果与讨论 ２．１ 中性蛋白酶水解的单因素分析 ２．１．１ 酶解时间的影响 在中性蛋白酶酶解反应体系 中， 控 制 酶 的 添 加 量 为３０００Ｕ／ｇＳＰＩ， ［ｓ］（底 物 浓 度）为 １０％， 于ｐＨ为７、温度５０℃时反应， 根据 以 往 文 献 的 报道及试验能耗的考虑， 设计时间因素试验时采用 ０．２５ｈ、０．５ｈ、１．０ｈ、１．５ｈ、２．０ｈ ５个梯度的单因素试验 以测量其对溶解性的影响， 结果见图１。由图１可知， 随 着 时 间 的 延 长 ， ＳＰＩ溶 解 性 增 加 很 快 ； １．０ｈ 以 后 ， 继续水解， 对ＳＰＩ溶解性贡献很小。
植物蛋白厂； 中性蛋白酶（活力≥２０万Ｕ／ｇ）： 广西南宁庞 博生物工程有限公司； 谷氨酰胺转胺酶（活力１００Ｕ／ｇ）： 江苏一鸣精细化工有限公司； Ｄ－ ０２６高分子量标准蛋 白： 北京市莱博生物实验材料研究所；
ＲＶＡ－ ３Ｄ型快速黏度分析仪： 澳大利亚Ｎｅｗｐｏｒｔ公 司； ＰＨＳ－ ３Ｃ精密ｐＨ计： 上海雷磁仪器厂； ＵＶ１６００紫 外可见分光光度计： 北京瑞利分析仪器公司； 电子 天平： 北京赛多利斯仪器系统有限公司； 定时恒温 磁力搅拌器： 上海雷磁仪器厂新泾分厂； 垂直板电 泳仪： 北京市六一仪器厂。 １．２ 试验方法 １．２．１ ＳＰＩ的酶解反应 按一定底物浓 度 称 取ＳＰＩ于 反 应瓶中， 加入适量蒸馏水， 搅拌。等ＳＰＩ溶解 后 ， 在 恒 温水浴中搅拌１５ｍｉｎ并 调 至 所 需 温 度 。同 时 用１５％ ＨＣｌ溶液调节至所需的数值， 然后加入一定量的中性 蛋白酶进行水解反应， 以０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液调节ｐＨ 值， 使ｐＨ值波 动范围小于０．１， 反应到预定时间后记 下 加 入 的ＮａＯＨ毫 升 数 ， 将 酶 解 液 迅 速 在 １００℃水 浴 ３ｍｉｎ钝化蛋白酶。取上清液存入冰箱， 待测定。根据 滴 入 的ＮａＯＨ体 积 计 算 水 解 度 。 水 解 度（ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ， ＤＨ）的控制和计算根据ｐＨ－ Ｓｔａｔ法［１］。 １．２．２ ＴＧ改性ＳＰＩ的制作 将酶解后的ＳＰＩ溶液加入谷 氨酰胺 转胺酶进行复合改性， ＴＧ用 量 为３０００Ｕ／ｇＳＰＩ， ｐＨ７．０、５０℃下反应１ｈ。 １．３ 试验分析方法
中图分类号：ＴＳ２０１．２＋５
文献标识码：Ａ
文章编号：１００５－ ９９８９（２００５）１２－ ００１１－ ０３
Ｅｘｐｅ ｒｉｍｅ ｎｔ ｏｆ ｐｒｏｍｏｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａ ｌ ｐｒｏｐｅ ｒｔｉｅ ｓ ｏｆ ｓ ｏｙｂｅ ａ ｎ ｐｒｏｔｅ ｉｎ ｉｓ ｏｌａ ｔｅ ｂｙ ｃｏｍｐｒｅ ｈｅ ｎｓ ｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ
图４ 酶浓度对溶解性影响的试验结果
由图４可知， 随着酶浓度的增大， 溶解度上升很 快。但酶浓度继续上升， 大于３０００Ｕ／ｇＳＰＩ后， 溶解度 增加较缓。从节约成本的角度， 确定酶解反应的酶 浓度为３０００Ｕ／ｇＳＰＩ。 ２．２ 大豆分离蛋白酶解改性的正交实验
表１ 工艺参数正交试验方案及结果分析
因素
在 此 基 础 上 ， 继 续 对 酶 解 产 物 进 行ＴＧ改 性 ， 最 终 改 性 后 的 ＳＰＩ与 对 照 及 酶 解 改 性 的 ＳＰＩ的 功 能 性 对 比 见表２。
表２ 不同改性处理ＳＰＩ的功能性比较
功能性 溶 解 性 （％） ２０℃黏 度 （ｃｐ） ９５℃黏 度 （ｃｐ） 耐 热 性 （ｃｐ） 凝 胶 性 （ｃｐ） 发 泡 性 （％） 泡 沫 稳 定 性 （％） 乳 化 性 （％） 乳 化 稳 定 性 （％） 吸 水 性 （ｇ／ｇ） 保 水 性 （ｇ／ｇ） 吸 油 性 （ｇ／ｇ）
ＳＵＮ Ｈｕａｎ， ＺＨＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ ｈｏｎｇ， ＣＨＥＮ Ｈａｉ－ ｙｉｎｇ， ＬＩＡＮ Ｆｕ－ ｆｅｉ， ＬＩＵ Ｃｈａｎｇ－ ｊｉａｎｇ
（Ｆｏｏｄ Ｓ ｃｉｅ ｎｃｅ Ｃｏｌｌｅ ｇｅ ｏｆ Ｓ ｈｅ ｎｙａ ｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ ｌ Ｕｎｉｖｅ ｒｓ ｉｔｙ， Ｓ ｈｅ ｎｙａ ｎｇ １１０１６１）
中性蛋白酶酶活测定方法： 采用紫外分光光度 法 ＱＢ１８０５．３－ １９９３； ＳＰＩ吸 水 性 、 保 水 性 、 吸 油 性 的 测定［２］： 采用肿胀法， 利用改性的Ｂａｕｍａｎｎ仪测定； ＳＰＩ 凝胶性的测定： 采用快速黏度分析仪测定； ＳＰＩ乳 化 性和乳化稳定性的测定： 详见参考文献［３］； ＳＰＩ发泡性
由图３可知， 酶解反应的适宜ｐＨ值在６．５￣７．５。 ２．１．４ 中性蛋白酶浓度的影响 控制［ｓ］为１０％， 于ｐＨ 为 ７、 温 度 ５０℃时 反 应 ， 时 间 １ｈ。 酶 的 梯 度 １０００Ｕ／ｇ
图３ ｐＨ值对溶解性影响的试ｇＳＰＩ、５０００Ｕ／ｇ ＳＰＩ， 结果见图４。由此条件反应来影响溶解性变化。