多发性骨髓瘤成骨细胞活性和Runx2的表达

多发性骨髓瘤成骨细胞活性和Runx2的表达
郑晓强
陈君敏
（福建医科大学附属第一医院血液科，福建福州350000）
〔摘要〕目的
研究多发性骨髓瘤（MM ）患者间充质干细胞（MSCs ）向成骨细胞（OB ）分化过程中Runx2的表达，探讨MM 骨形成障碍的机
制。

方法
以4例有明显骨质破坏的MM 患者为研究对象，2例缺铁性贫血和1例特发性血小板减少性紫癜为对照，体外诱导MSCs 向OB 分化，采
用CCK-8试剂盒检测MSCs 向OB 分化过程中的增殖能力，以平均光密度值（AOD ）表示；碱性磷酸酶（ALP ）染色和钙结节（Von-Kossa ）染色检测MSCs 的OB 形成能力，分别以IOD sum /Area sum 值和平均钙结节个数表示；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR ）技术检测MSCs 向OB 分化过程中Runx2的表达，以Runx2/GAPDH 平均光密度值表示。

结果在MSCs 向OB 分化过程中，MM 患者MSCs 的增殖能力、ALP 表达、钙结节形成能力、
Runx2表达均明显低于对照组（P ＜0.01）。

结论
MM 患者骨髓MSCs 向OB 分化过程中的增殖能力和OB 形成能力均下降，可能与Runx2的表达减低有关。

〔关键词〕多发性骨髓瘤；间充质干细胞；成骨细胞
〔中图分类号〕R551.3
〔文献标识码〕A
〔文章编号〕1005-9202（2011）22-4366-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2011.22.036
Osteoblast activity and Runx2expression in multiple myeloma
ZHENG Xiao-Qiang ，CHEN Jun-Min.
Department of Hematology ，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University ，Fuzhou 350000，Fujian ，China
【Abstract 】Objective To evaluate Runx2expression of mesenchymal stem cells （MSCs ）from bone marrow of multiple myeloma （MM ），and discuss the mechanism of osteoblast inhibition in MM.Methods Bone marrow was collected from four MM patients with obvious osteolytic lesion.The control group included two patients with iron deficiency anemia and one with idiopathic thrombocytopenic purpura.MSCs were induced to differentiate into OB in K-8kit was employed to analyze MSCs proliferation ，defined as the average optical density
（AOD ）.Alkaline phosphatase staining and Von-Kossa staining were performed to assess osteoblast formation ，defined as IOD sum /Area sum
and the average of calcium nodules respectively.RT-PCR assays were applied to detect Runx2expression of MSCs ，defined as Runx2/GAPDH
average optical density.Results There was significant difference in the proliferation of MSCs between MM and control group.The osteoblast formation was less in MM group than that of control group.RT-PCR assays showed that Runx2expression was significantly lower in MM than
that in control group （all P ＜0.01）.Conclusions In the course of differentiation of MSCs into OB ，
bone marrow MSCs from MM patients are characterized with a low proliferation and osteoblast formation ，
which may be associated with lower expression of Runx2.【Key words 】Multiple myeloma ；Mesenchymal stem cells ；Osteoblasts
基金项目：国家自然科学基金（No.30871111）
通讯作者：陈君敏（1963-），男，博士，主任医师，主要从事血液病学研
究。

第一作者：郑晓强（1982-），男，硕士，医师，主要从事血液病学研究。

骨髓瘤骨病（MBD ）是由于破骨细胞（OC ）活性增强及成骨
细胞（OB ）活性受抑制的结果〔1〕
，是多发性骨髓瘤（MM ）的特
征性病变。

近年来，
MM 患者中存在OB 发育障碍受到广泛关注，其机制还不清楚，
Runx2是调控OB 发育的关键因子〔2〕
，其
是否参与MM 骨形成障碍的机制，国内尚未见有报道。

本文对MM 患者间充质干细胞（MSCs ）向OB 分化过程中的生物特性和Runx2的表达进行研究。

1材料与方法1.1
材料
L-DMEM 培养基干粉、PBS 粉剂、0.25%胰蛋白酶
（Gibco 公司），人淋巴细胞分离液（上海试剂二厂，比重1.077ʃ0.001），新生胎牛血清、青链霉素（Hyclone 公司），地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C （美国Sigma 公司），BCIP /NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒（碧云天生物技术研究所），引物合成（上海生工），
Trizol 液（Tri Reagent 公司），cDNA 第一链合成试剂盒（Fermentas 公司），聚合酶链反应试剂、标记物、焦碳酸二乙酯、
PCR Master Mix 、琼脂糖（厦门泰京生物工程有限公司）。

1.2
骨髓间充质干细胞的分离和培养
MM 组骨髓标本取自
4例MM 患者，经骨髓细胞学、病理学、影像学和血液生化检查，符合MM 诊断标准
〔3〕
，全身多处骨质破坏，国际分期系统（ISS ）
均为Ⅲ期。

其中男3例，女1例，平均年龄（64.3ʃ4.92）岁，4例均为IgG 型，其中К轻链型3例，λ轻链型1例。

对照组骨髓标本为2例缺铁性贫血，
1例特发性血小板减少性紫癜。

平均年龄（58.8ʃ5.63）岁。

抽取骨髓液5ml ，加入肝素管中，颠倒混匀防止凝固。

加入等体积PBS ，混匀，1000r /min 离心5min ，去除脂肪及上清。

加入等体积PBS ，吹打混匀。

将细胞悬液加至盛有等体积淋巴细胞分离液的离心管中，
2500r /min 离心30min 。

收集中间层面云雾状单个核细胞层，L-DMEM 培养液（为含10%新生胎牛血清、100U /ml 青霉素和100U /L 链霉素的低糖DMEM ）洗涤细胞，
1000r /min 离心5min 。

调整细胞密度为106/ml ，接种于25cm 2
培养瓶，放入37ħ，
5%CO 2培养箱。

培养5d 后首次换液，
以后每3天换液，每日倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。

当细胞汇合到90%时（约2w ），用0.25%胰蛋白酶消化，按1ʒ2比例传代。

1.3
MSCs 的增殖能力
MSCs 培养至3代，2ml 0.25%胰蛋
白酶溶液37ħ消化，制成单细胞悬液。

用含地塞米松
·6634·中国老年学杂志2011年11月第31卷
（10－8mol/L）、维生素C（0.05g/L）和β-甘油磷酸钠（10－2mol/L）的L-DMEM条件培养液调节细胞浓度至45000/ml，吸取调整好的细胞悬液100μl至0.32cm2的96孔
板，设3个复孔，上下平行对照，连续接种7板，按照CCK-8试剂盒说明书每隔24小时测量1板，连续测量7d。

吸净孔板中培养液，增设1孔未接种细胞的孔调零，每孔加入100μl无血清培养基和10μl CCK-8溶液，置于37ħ，5%CO
2
培养箱孵育2h，在酶标仪450nm处读取OD值，打印数据。

1.4MSCs的OB形成能力将培养至第3代MSCs采用含地塞米松（10－8mol/L）、维生素C（0.05g/L）和β-甘油磷酸钠（10－2mol/L）的L-DMEM条件培养液重新悬浮，接种105个细
胞至放有载玻片的6孔板，放入37ħ，5%CO
2
培养箱培养，每3天半量换液。

分别在第14天和第28天取出盖玻片（即细胞爬片）进行ALP和Von Kossa染色。

显微镜底下每个标本选取10个100倍视野，用Image-Pro Plus6.0专业图像分析软件计算IOD sum/Area sum值，比较MM组和对照组ALP的表达。

光镜下人工随机计数钙结节个数，比较MM组和对照组钙结节形成能力。

1.5MSCs Runx2的表达
1.5.1对照组MSCs样品准备取对照组第3代的MSCs，接种106个细胞至6孔板，每3天完全培养液换液，待细胞约80%融合后，吸净完全培养液，加入条件培养液进行诱导，分别在诱导的第0、24、48、72小时收集细胞。

1.5.2MM组MSCs样品准备取MM组和对照组第3代的MSCs，接种106个细胞至6孔板，每3天完全培养液换液，待细胞80%融合后，吸净完全培养液，加入条件培养液，72h后收集细胞。

收集1ˑ106个细胞置于一EP管，细胞总RNA提取及逆转录按试剂盒说明书进行操作。

放置PCR仪进行扩增，引物序列如下：Runx2引物：上游：5'-TGCTGGAGTGATGTG-GTTTTCT-3'，下游：5'-CCCCTGTTGTGTTGTTTGGTAA-3'，扩增片段长度为276bp。

内参GAPDH引物：上游：5'-ACCACAGTC-CATGCCATCA-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，扩增片段长度450bp。

扩增条件：94ħ预变性5min，94ħ变性30s，52ħ退火50s，72ħ延伸1min，35个循环后72ħ延长10min。

取10PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，电压为110V，电流与电压相对应，时间为40min，缓冲液为0.5ˑTAE，指示剂为溴酚兰，凝胶成像自动分析仪下照相，并计算Runx2/GAPDH的平均光密度值。

1.6统计学处理数据均以xʃs表示，采用SPSS13.0软件分析数据，数据呈正态分布采用t检验或方差分析，非正态分布采用非秩和参数检验。

2结果
2.1MM患者骨髓MSCs的增殖能力CCK-8试剂盒检测MSCs增殖能力的数据显示，在条件培养液诱导下，MM组和对照组MSCs在第3 4天均进入对数生长期，第5天增殖速度下降，细胞增殖进入平台期。

诱导7d，MM组MSCs增殖能力低于对照组，平均光密度（AOD）值分别为1.195ʃ0.631和1.493ʃ0.890（t=2.163，P＜0.05）。

2.2MM患者骨髓MSCs向OB的分化能力MM组ALP表达和平均钙结节个数均明显低于对照组，IOD sum/Area sum值分别为0.204ʃ0.050和0.339ʃ0.034（t=12.132，P＜0.01），平均钙结节个数分别为16.7ʃ5.61和11.1ʃ6.14（Z=－
3.494，P＜0.01）。

2.3MM患者骨髓MSCs Runx2的表达MSCs未被诱导时可弱表达Runx2，72h后呈强表达，Runx2/GAPDH平均光密度值分别为0.637ʃ0.074和0.973ʃ0.086（P＜0.01）。

且MM组Runx2的表达明显低于对照组，Runx2/GAPDH平均光密度值分别为0.412ʃ0.199和0.734ʃ0.149（t=5.761，P＜0.01）。

3讨论
MM骨病是由于MM骨髓微环境中的骨髓瘤细胞产生OC 刺激因子，如TNF-α、RANKL、MIP-1α、SDF-1α、IL-1β、IL-6、IL-3等刺激OC的增殖与分化，而增殖成熟的OC通过直接或间接的作用促进骨髓瘤细胞的增殖并使其免于凋亡，从而形成一个恶性循环，导致MM骨病的发生〔1，4〕。

缓解期的MM患者尽管骨髓中无骨髓瘤细胞且OC活性完全被抑制，但其溶骨性病变并未见好转〔5〕，骨髓瘤细胞和OC的恶性循环学说不能解释这一点。

骨髓MSCs的OB分化障碍亦参与了MM骨病的发生。

胡晓丽等〔6〕对7例MM骨髓MSCs的OB形成能力研究表明，MM患者MSCs的OB形成能力显著降低。

本文结果说明，MM 患者具有MSCs一般的生物学特性，但是增殖能力和OB形成能力降低。

因此，目前认为，OC活性增强和OB发育障碍共同参与了MM骨病的发生〔7 12〕。

关于OB发育障碍的机制，目前还不清楚，近年来的研究认为，OB特异性转录因子Runx2参与其中。

Runx2是OB分化的特异性标志，它属于转录因子RUNX家族，可限制性地表达于骨组织中。

Runx2－/－小鼠由于OB分化障碍而表现为膜内骨及软骨内钙化的完全缺失〔13〕。

Runx2在MSCs向OB分化过程中起着决定性作用，在分化早期，决定着MSCs向成骨系细胞分化，分化为OB后，Runx2使OB保持在未成熟阶段，抑制其向成熟骨细胞的转变〔2〕。

本结果显示，MSCs未被诱导时便弱表达Runx2，这可能与MSCs具有潜在分化OB的功能有关，因此我们推测，MSCs传至3代后，便有潜在分化OB的可能。

ALP和钙结节形成是OB成熟的标志，呈强阳性表达分别需要诱导14d和28d，而Runx2在MSCs诱导24、48h后表达逐渐增强，72h后呈强表达，这说明，Runx2在前成骨细胞期便呈强表达。

对MM组和对照组MSCs向OB分化过程中Runx2的表达进行比较，结果显示MM组Runx2的表达明显低于对照组。

这一结果与Giuliani的研究是一致的，他们用免疫组化方法对40例MM患者的骨组织进行检测发现，MM骨髓微环境中Runx2表达明显低于正常人〔7〕。

以上结果表明，Runx2主要作用于MSCs向成骨系细胞分化的早期，MM患者MSCs OB形成能力能力下降可能与其Runx2的表达减少有关。

4参考文献
1Barille-Nion S，Bataille R.New insights in myeloma-induced osteolysis 〔J〕.Leuk Lymphoma，2003；44：1463-7.
·
7634
·
郑晓强等多发性骨髓瘤成骨细胞活性和Runx2的表达第22期
2Komori T.Regulation of osteoblast differentiation by transcription factors 〔J 〕.J Cell Biochem ，2006；99（5）：1233-9.
3Kyle RA ，Rajkumar SV.Multiple myeloma 〔J 〕.N Engl J Med ，2004；351：1860-73.
4
Yaccoby S ，Wezeman MJ ，Henderson A ，et al .Cancer and the microenvi-ronment ：myeloma-osteoclast interactions as a model 〔J 〕.Cancer Res ，2004；64：2016-23.5Epstein J ，Walker R.Myeloma and bone disease ：“the dangerous tango ”〔J 〕.Clin Adv Hematol Oncol ，2006；4（4）：300-6.6
胡晓丽，冯磊，傅晋翔，等.骨髓瘤细胞抑制骨髓问充质干细胞向
成骨细胞的转化〔J 〕
.中国组织工程研究与临床，2007；11（46）：9221-5.7
Giuliani N ，Colla S ，Morandi F ，et al .Myeloma cells block RUNX2/CBFA1activity in human bone marrow osteoblast progenitors and inhibit osteoblast formation and differentiation 〔J 〕.Blood ，2005；106（7）：2472-83.8
Ehrlich LA ，Chung HY ，Ghobrial I ，et al .IL-3is a potential inhibitor of osteoblast differentiation in multiple myeloma 〔J 〕.Blood ，2005；106（4）：1407-14.9
Oshima T ，Abe M ，Asano J ，et al .Myeloma cells suppress bone formation
by secreting a soluble Wnt inhibitor ，sFRP-2〔J 〕.Blood ，2005；106（9）：3160-5.
10
Weitzmann MN ，Roggia C ，Toraldo G ，et al .Increased production of IL-7uncouples bone formation from bone resorption during estrogen deficien-cy 〔J 〕.J Clin Invest ，2002；110（11）：1643-50.
11Wang FS ，Ko JY ，Lin CL ，et al .Knocking down dickkopf-1alleviates es-trogen deficiency induction of bone loss.A histomorphological study in ovariectomized rats 〔J 〕.Bone ，2007；40（2）：485-92.
12Tian E ，Zhan F ，Walker R ，et al .The role of the Wnt-signaling antago-nist DKK1in the development of osteolytic lesions in multiple myeloma 〔J 〕.N Engl J Med ，2003；349（26）：2483-94.
13
Kato M ，Patel MS ，Levasseur R ，et al .Cbfa1-independent decrease in os-teoblast proliferation ，osteopenia ，and persistent embryonic eye vascular-izationin mice deficient in Lrp5，a Wnt coreceptor 〔J 〕.J Cell Biol ，2002；157：303-14.
〔2011-07-25收稿2011-10-30修回〕
（编辑曹梦园）
眼针对急性脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织脑源性神经因子表达的影响
王
哲
王德山
王莹马贤德赵金茹王守岩关洪全（辽宁中医药大学，辽宁沈阳110032）
〔摘
要〕目的
探讨眼针治疗急性脑缺血再灌注损伤的机制。

方法应用线栓法复制急性脑缺血再灌注损伤大鼠模型，采用眼针治疗，于再
灌注后3h 进行神经功能缺损评分，采用免疫组化、Western 印迹、实时荧光定量聚合酶链反应（RQ-PCR ）方法测定脑组织脑源性神经因子（BDNF ）蛋白及mRNA 表达的变化。

结果与模型组比较，眼针组大鼠神经功能缺损评分明显下降，脑组织BDNF 蛋白及mRNA 表达明显上调（P ＜0.05）。

结
论
眼针具有明显改善大鼠脑缺血再灌注损伤的作用；其机制与上调脑组织BDNF 表达有关。

〔关键词〕眼针；急性脑缺血再灌注损伤；脑源性神经因子〔中图分类号〕R743
〔文献标识码〕A
〔文章编号〕1005-9202（2011）22-4368-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2011.22.037
Effect of eye acupuncture therapy on brain-derived neurotrophic factor expression in acute cerebral ischemia-reperfusion injury rats
WANG Zhe ，WANG De-Shan ，WANG Ying ，et al .Liaoning University of Traditional Chinese Medicine ，Shenyang 110032，Liaoning ，China
【Abstract 】Objective To investigate the effect of eye acupuncture therapy on cerebral brain-derived neurotrophic factor （BDNF ）
expression in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury and the related mechanism.Methods Rat model of cerebral ischemia-reperfu-sion was established by suture method.The methods of immunohistochemistry staining ，Western-blotting and RQ-PCR were taken to detect the alteration of the BDNF protein and BDNF mRNA in rat brains after eye acupuncture therapy.Results Compared with the model group ，
the neurologic impairment score of the eye-acupuncture group was decreased obviously and the expression of the BDNF protein and BDNF
mRNA in rat brains after eye acupuncture therapy was strongly increased （P ＜0.05）.Conclusions Eye acupuncture therapy can reduce the cerebral ischemia-reperfusion injury evidently by increasing the expression of the cerebral BDNF protein.
【Key words 】Eye acupuncture ；Cerebral ischemia-reperfusion injury ；Brain-derived neurotrophic factor （BDNF ）
基金项目：国家重点基础研究发展计划项目（2007CB512702）
通讯作者：王德山（1951-），男，教授，主要从事中医学肺、脾、肾功能调
控机体水液代谢的机制研究。

第一作者：王
哲（1971-），女，教授，博士，主要从事中医肺、肾调控机体水液代谢机制研究。

缺血性脑血管病约占全部脑血管患者的70% 80%。

脑
缺血可诱导产生多种神经营养因子，它们可以与神经干细胞上的相应受体结合激活细胞内的信号系统，从而促进其分化，部分地替代和修复受损的神经元，从而在一定程度上改善神经功能缺损。

脑源性神经因子（BDNF ）在脑中分布广泛，其分布包括皮质、海马、基底前脑、纹状体、下丘脑和小脑，不仅分布于神经细胞体而且延伸到纤维，是脑中含量最多的神经营养因子，
·8634·中国老年学杂志2011年11月第31卷。