RT-PCR操作流程及其相关注意事项

RT-PCR
一知识背景：
1、基因表达：DNA RNA Protein
2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。

在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。

反应分三步：
A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；
B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。

C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。

以上三步为一个循环，如此反复。

3、逆转录酶和RT-PCR
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：
1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；
2、RNase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；
3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.
4、引物的设计及其原则：
引物的特异性决定PCR反应特异性。

尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。

a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。

b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。

GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm 值减去5～10度。

c、3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。

末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。

d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。

e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3’端不应超过2个。

f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。

g、5’端无严格限制：5’末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。

还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。

根据实验目的选择适当的引物。

常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。

RNA提取（用Trizol法提取）
RNA提取的一般步骤是：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA
注意事项：
1、整个操作过程中总是带着帽子、口罩和手套
2、整个RT-PCR过程均必须使用无菌无RNA酶的制品（玻璃物品和饭盒需在180℃烤箱烘烤10h，注意烘烤时最好是早上开180℃烤箱，晚上到时间后一定要关掉，第二天早上将所需物品取出。

取东西时需带好帽子和口罩，轻柔操作，防止有空气逆流入烤箱引起RNA 酶污染；塑料制品泡1‰DEPC水72h,DEPC水提前一天配制，并用玻璃棒搅拌混匀。

连续高温高压消毒3次，以充分降解DEPC。

）
3、除非特别注明，所有程序均在室温（15~30℃）下进行，试剂也放置于室温。

4、提RNA前，收拾干净试验台，尽量不要放无关的物品；将试验台桌面用普通的75%酒精仔细擦两遍；将所需用到的移液器全部用普通的75%酒精仔细擦拭干净。

需要的试剂：
氯仿、异丙醇（装此试剂的广口瓶，瓶盖最好用锡箔纸包一下）
75%乙醇（溶于DEPC处理的水中）
DEPC-treated water：100ul DEPC +100 ml ddH2O制成1‰DEPC水，放入RNase-free的玻璃瓶中用RNase-free的玻璃棒搅拌，静置12小时以上，高温高压消毒。

RNase-free H2O的制备：把水加入到RNase-free的玻璃瓶中，加入DEPC至0.01%（v/v）,静置过夜，高压蒸汽灭菌，连续3遍。

需要的器具：
100ml棕色广口瓶2个、100ml白色广口瓶4个、钳子2把、饭盒一个、100ml量筒一个、蓝、黄、白Tip头若干、1.5EP管、0.5EP管、PCR管若干、PE手套、锡箔纸若干、4℃离心机需提前降温、1200ul、1000ul、400ul平衡管，大培养皿一套，滤纸、滴管3支，比色皿1个
操作步骤：
1、均质化：
单层培养的细胞，直接在培养瓶中裂解。

倒掉培基，中号培养瓶中直接加入1ml Trizol 试剂（含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶），加入后即反复抽吸、吹打细胞数次（约20~40次）
↓
室温(15~30℃)孵育5min（以利于匀浆样品中核蛋白体完全解离）
↓
转移均质溶液到新的1.5mlEP管中
2、相分离：
↓
每1mlTrizol 试剂加入200ul 氯仿，小心盖紧管盖（单手操作；将装氯仿和异丙醇的广口瓶放在正前方远离自己的位置，操作时不会越过瓶口上方造成污染；取氯仿时，不要把瓶盖放
在桌面上，取完立即盖好瓶盖）
↓
用手剧烈震荡15s
↓
室温(15~30℃)静置2~3min （2~15min ）
↓
4℃ 12000g 离心15min(将EP 管在离心机取出时需十分小心，尽量不要使EP 管晃动)
↓
RNA 存在于水相中，水相体积约为60%均质化时使用的Trizol 试剂量
3、 RNA 沉淀
↓
水相转移至一个新的1.5mlEP 管【注意：EP 管垂直；枪垂直、贴壁、用200ul 枪缓慢抽；
一共最多抽400ul ，宁缺勿滥】
↓
混合冷的异丙醇 (或冷的乙醇：因DNA 、RNA 都溶于水而不溶于乙醇或异丙醇，因此，常用乙醇来沉淀溶液中的DNA 和RNA 。

DNA 溶于苯酚而RNA 不溶，故可用苯酚来沉淀RNA 。

乙醇能够消除RNA 的水化层，从而使RNA 从水中沉淀下来）， 以从水相中沉淀RNA ，每1ml 用于初始同质化的Trizol 试剂，使用500ul 异丙醇，轻轻颠倒混匀1~2次
↓
室温(15~30℃)孵育样品10min(5~10min)【将逆转录的试剂置于冰上溶解备用】
↓
4℃ 12000g 离心10min(往往离心前RNA 沉淀不可见，离心后在管侧面和底部形成一个凝胶
样沉淀)
4、 RNA 洗涤
↓
弃上清（缓慢倒出）
↓
用75%乙醇（25%的水去无机盐）洗涤RNA 沉淀一次
↓
每ml 用于初始同质化的Trizol 试剂使用至少1ml75%乙醇（可用75%乙醇预洗一次——放
进去乙醇，不漩涡，小心倒掉；再加入1ml 乙醇）
↓
漩涡混合
↓
4℃ 7500g离心5min
↓
缓慢倒出上清液，再用小离心机离心数秒，用20ul的枪移走剩余的水，以保证整个EP管的
干燥是同步的。

整个过程一定要小心。

5、重新溶解RNA
↓
简单干燥RNA沉淀(让乙醇充分挥发)——空气干燥5~10min【将有RNA沉淀的EP管放入装有滤纸的大培养皿中；不要让RNA沉淀完全干燥，这将大大降低其溶解度】
↓
用无RNAse free water（经DEPC 处理的水）（逆转录试剂盒里的一般用不完）20ul吹打
几次，溶解RNA
↓
用紫外分光光度计测定A260/A280及RNA的浓度1.8~2.0比较好（或电泳）
注：
1、紫外分光光度计的使用：
打开后面的电源→按RNA→确定RNA对应的设置时1OD=40 →向比色皿中加入50ul高温消毒之后的三蒸水→blank→将其中的水吸出→加入3ulRNA+47ul三蒸水漩涡混匀后的样品→dilution→enter→sample（默认光程为10mm，比色皿光面对着自己）
2、融解RNA一般使用TE Buffer，保存RNA应该尽量低温（TE缓冲液是弱碱性,对DNA 的碱基有保护性,(DNA在它是的稳定性较好,不易破坏其完整性或产生开环及断裂),包括提取好的DNA也要放在TE缓冲液保存.）
逆转录（应用GeneCopoeia TM First Strand cDNA Synthesis Kit）
：1、准备：缓慢颠倒混匀试剂，避免起泡，并经瞬时离心后，放置冰上待用。

用于制备RNA-Primer Mix的EP管需在冰上预冷。

2、制备RNA-Primer Mix（RNA--引物混合），轻弹几下混匀，瞬时离心
3、变性RNA
↓
65℃加热RNA-Primer Mix，10min（RNA二级结构打开，增加反应产量）
↓
立即放置冰上冷却（消除RNA大多数二级结构，从而使引物可以结合）、
↓
4、配制逆转录反应液：
在已冷却的RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25 μl。

试剂组分体积终浓度
RNA-Primer Mix 13 μl
5×RT Reaction Buffer 5 μl1×
25 mM dNTP 1 μl 1 mM
25 U/μl RNase Inhibitor 1 μl 1 U/ul
200U/ul M-MLV RTase (RNase H-) 1 μl8U/ul
ddH2O (DNase/RNase Free) 4 μl
总体积25ul
5、逆转录反应
↓
混匀反应Mix，瞬时离心，42℃ 60min
6、灭活并保存逆转录产物
↓
加热至85℃ 5min,终止反应→在PCR仪上设置4℃ hold
↓
将cDNA保存于-20℃
RT-PCR的步骤
⑴在冰浴离心管里面加入模板RNA 4uL，引物2uL，去离子水5uL，混匀，离心3-5秒；
⑵70度水浴5分钟，冰浴30秒（此处是为了使引物和模板正确配对）；
⑶加入5×反应液4uL，RNase抑制剂1uL，dNTP 2uL（这些应该先配好，然后分再装到每一管），混匀；
⑷37度水浴5分钟，加入1uL AMV-RT反转录酶，混匀；
⑸37度水浴1小时（此步是反转录过程）；
⑹70度10分钟结束反应（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰），产
物置冰上进行下一步PCR实验，余下的-70度保存。

PCR阶段：
反应体系50μL=PCR-Mix+模板+引物1+引物2+去RNA酶的水
反应条件：95℃预变性5min后，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min；共进行35个循环后72℃延伸10min。

取10μL产物1.0%琼脂糖凝胶电泳、照相。

并采用凝胶图像处理软件ImageTool（IT）3.0测量灰度值，计算mRNA表达的相对值。

计算方法：mRNA表达的相对值＝目的基因灰度值／
β-actin灰度值。

凝胶电泳：
1、先高火煮琼脂糖，见快要冒泡时即转到低火，直至溶液清亮为止。

开始可能会冒泡比较多，不要让其溢出来，之后就不会冒出来了。

2、灌胶时，先缓慢灌胶再插梳齿，不容易出气泡。

3、电泳缓冲液最好每次都用新的；至少要保证电泳缓冲液中不能有很多气泡。

3、胶跑到中间时，可以放到机子上去显影，看有无目的条带，是否需要继续跑。

trizol试剂盒提取总RNA。

取2μg总RNA进行逆转录后各取7.5μL行PCR反
应，β-actin为内参照。

TRX引物：上游为5'-CATATGGTGAAGCAGATCGAGAG-3’，
下游为5’- TGTCACGCAG A T G GCAACTG -3’，扩增片段大小为420bp。

β-actin引物：上游为5'-CCTTCCTG GGCATGGAGTCCT-3'，
下游为5'- GGAGCAATGATCTT GATCT T-3'，扩增片段大小为204bp。

4、分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖浓度
琼脂糖浓度（％）线性DNA片段的有效分离范围（kb）
0.5 1－30
0.7 0.8－12
1.0 0.5－10
1.2 0.4－7
1.5 0.2－3
5、电泳缓冲液配方：
TAE（Tris-乙酸）工作液贮存液/1000ml
(1×) (50×)
40mmol/L Tris-乙酸242g Tris-base
1mmol/ L EDTA 57.1ml 冰乙酸
100ml 0.5mol/L EDTA(PH=8.0)
TBE (Tris-硼酸) 0.5× 5×
45 mmol/L Tris-硼酸54g Tris-base
1mmol/ L EDTA 27.5g硼酸
20ml 0.5mol/L EDTA(PH=8.0)
0.5mol/L EDTA (PH=8.0)
18.61g EDTA-Na.2H2O + 80ml H2O 调PH=8.0 定容至100ml(开始EDTA非常约2g NaOH（或10mol/L NaOH约5ml）难溶，在常温调PH后即可全溶。