NF-κB和Nrf2信号通路在成肌细胞抗氧化应激中的作用

山西农业科学 2023，51（11）：1252-1259Journal of Shanxi Agricultural Sciences
NF-κB 和Nrf2信号通路在成肌细胞抗氧化应激中的作用
李
君 1，王鹤洁 1
，安
洁 2，李俊玲 1，窦敏敏 1，翟竹汇 1
，
何浪 1，李振月 1，秦
健 1，2，3
，杜
荣
1
（1.山西农业大学 动物医学学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801；
3.山西农业大学 实验教学中心，山西 太谷 030801）
摘要：成肌分化是动物肌肉发育的关键环节，与其健康和生产性能密切相关。

为研究成肌细胞抗氧化应激的
机制，试验分离了绵羊胎儿成肌细胞，利用地塞米松处理分化中的成肌细胞建立氧化应激模型；试验分为4组，包括正常分化48 h 组（N 48 h ）、地塞米松处理分化48 h 组（Dex 48 h ）、正常分化72 h 组（N 72 h ）、地塞米松处理分化72 h 组（Dex 72 h ），通过倒置显微镜观察各组细胞的形态变化，利用ROS 检测试剂盒检测ROS 含量，用RNA -seq 检测NF -κB 和Nrf2信号通路相关基因mRNA 的表达情况，并采用皮尔森相关系数法分析相关性，用STRING 数据库分析蛋白的互作关系。

结果表明，地塞米松诱导的氧化应激对成肌分化具有明显的抑制作用，且抑制作用随处理时间的延长而增加；ROS 含量较各自对照组均显著增加，且随着处理时间的延长而增加。

由RNA -seq 分析结果可知，与对照组相比，地塞米松处理组NF -κB 和Nrf2信号通路被激活，上游基因P65、IKK2、IκBα、IκBβ、Nrf2、Keap1以及相应下游靶基因SOD1、SOD2、FHC 、HO -1、GSH -Px 的mRNA 相对表达量均显著升高，各基因之间存在不同程度的相关性以及错综复杂的蛋白互作关系，其中Keap1基因是联系2条通路的重要枢纽。

综上所述，在成肌细胞分化过程中，NF -κB 和Nrf2信号通路交互联系，共同在地塞米松诱导的成肌细胞氧化应激中发挥抗氧化作用。

关键词：绵羊；成肌细胞；成肌分化；RNA -seq ；氧化应激；NF -κB 通路；Nrf2通路中图分类号：Q27 文献标识码：A 文章编号：1002‒2481（2023）11‒1252‒08
Role of NF-κB and Nrf2 Signaling Pathways in Anti-Oxidative Stress of Myoblasts
LI Jun 1，WANG Hejie 1，AN Jie 2，LI Junling 1，DOU Minmin 1，ZHAI Zhuhui 1，
HE Lang 1，LI Zhenyue 1，QIN Jian 1，2，3
，DU Rong 1
（1.College of Veterinary Medicine ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ；
2.College of Life Sciences ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ；
3.Center of Experiment Teaching ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ）
Abstract ：Myogenic differentiation is a key link in animal muscle development and is closely related to its health and production performance. To study the mechanism of anti -oxidative stress of myoblasts, in this study, sheep fetal myoblasts were isolated, the oxidative stress model were established by treating differentiating myoblasts with dexamethasone. The test was divided into 4 groups, including normal differentiation 48 h(N 48 h), dexamethasone treatment differentiation 48 h(Dex 48 h), normal differentiation 72 h(N 72 h), dexamethasone treatment differentiation 72 h(Dex 72 h). The cell morphological changes of each group were observed by inverted microscopy, the ROS content was detected by ROS detection kit, and the mRNA expression of genes associated with NF -κB and Nrf2 signaling pathways was detected by RNA -seq. The correlation of genes was analyzed by Pearson correlation coefficient method, and the protein interaction relationship was analyzed in the STRING database. The results showed that the myogenic differentiation was significantly inhabited under the treatment of oxidative stress induced by dexamethasone, and the inhibitory effect was enhanced with prolongation of the treatment time. The ROS content significantly increased compared to the respective control groups, and increased with prolongation of the treatment time. RNA -seq analysis showed that the NF -κB and Nrf2 signaling pathways were activated in dexamethasone treatment group, the mRNA expression levels of upstream genes P65, IKK2, IκBα, IκBβ, Nrf2, Keap1 and corresponding downstream target genes SOD1,
doi
doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.11.03收稿日期：2023-03-03
基金项目：国家自然科学基金项目（32272964，31872438）；山西省基础研究计划（20210302123394）；山西省回国留学人员科研资助项目
（2022-102）；山西省留学回国人员科技活动择优资助项目；山西农业大学横向科技项目（2015HX12）；山西农业大学中青年拔尖创新人才支持计划（BJRC201204）
作者简介：李　君（1996-），男，山西忻州人，在读硕士，研究方向：动物细胞分子调控与生物工程。

通信作者：杜　荣（1971-），女，山西祁县人，教授，博士，主要从事动物细胞分子调控与生物工程研究工作。

1252
李君等：NF-κB和Nrf2信号通路在成肌细胞抗氧化应激中的作用
SOD2, FHC, HO-1, GSH-Px were significantly higher than those in the control. There were different degrees of correlation and intricate protein interactions among these genes, in which Keap1was an important hub connecting the two pathways. In summary, during the myoblast differentiation, NF-κB and Nrf2 signaling pathways interacted and jointly played an antioxidant role in the dexamethasone-induced oxidative stress of myoblasts.
Key words：sheep; myoblasts; myogenic differentiation; RNA-seq; oxidative stress; NF-κB pathway; Nrf2 pathway
氧化应激最初由SOHAL教授提出，指的是在机体受到各种内外环境的有害刺激时，体内会产生过多的高活性分子如活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（Reactive nitrogen species，RNS），而细胞内的抗氧化系统不能及时清理，会导致氧化与抗氧化系统的失衡，使细胞膜和线粒体以及遗传物质受到原发或继发性的损伤，严重情况下可能导致细胞发生癌变或者死亡[1-2]。

研究发现，核因子κB（NF-κB）和核因子E2相关因子2（Nrf2）是被过量ROS激活的2个主要转录因子，活化后的转录因子进入细胞核，引起下游各种靶基因的表达以抵抗不良影响[3]。

在NF-κB信号通路的多个靶点中，SOD2和FHC在抗氧化活性方面有着重要的作用，其中NF-κB可通过FHC的上调来抑制ROS，进而抑制肿瘤坏死因子诱导的细胞凋亡[4]；而CHANG等[5]研究发现，壳寡糖能够激活Nrf2途径，促进Nrf2介导的HO-1和GSH-Px基因表达，从而减少ROS水平，提高肉鸡的肉质。

骨骼肌约占动物身体的40%，其具有维持运动、代谢和支持身体的重要作用[6]。

骨骼肌发育的过程较为复杂，胚胎和围产期是决定动物骨骼肌生长性能的关键时期[7]。

现已明确地塞米松作为一种人工合成的糖皮质激素，因其在围产期有抗炎、镇痛、抗毒、抗过敏等多种优势被广泛使用。

但由于糖皮质激素受体几乎存在于所有的细胞中，高剂量或长期使用会产生一定的副作用[8]。

研究表明，地塞米松能够在体内和体外的骨骼肌细胞、成骨细胞以及脂肪细胞等多种类型的细胞中引起氧化应激损伤[9-10]。

氧化应激会使蛋白质代谢加快而抑制蛋白质的合成，最终引起肌肉发育不良或肌肉萎缩[11]。

目前，利用分离培养的成肌细胞诱导分化已被广泛应用于研究肌肉生成机制的体外模型[12-13]。

为探明在成肌分化过程中，NF-κB和Nrf2信号通路在地塞米松诱导的氧化应激中是否发挥作用，本试验以绵羊成肌细胞为研究对象，在其分化过程中，选用地塞米松来诱导氧化应激，比较正常和应激状态下不同分化阶段NF-κB和Nrf2信号通路相关基因的表达变化，并分析各基因的相互关系，旨在为阐明骨骼肌细胞分化过程中的抗氧化机制奠定基础，同时为防治胎儿骨骼肌发育过程中受到的氧化损伤提供理论依据。

1　材料和方法
1.1　试验材料
绵羊胎儿成肌细胞由本实验分离培养所得。

主要试剂包括青霉素-链霉素（PS）、I型胶原酶、0.25%胰酶（TE）、马血清（HS）、地塞米松，均购于索莱宝；DMEM/F12、NBCS购于GIBCO公司；RNAiso Plus购于TaKaRa公司；活性氧检测试剂盒购于碧云天公司。

1.2　试验方法
1.2.1　绵羊胎儿成肌细胞的分离与培养　样品来自于太谷屠宰场屠宰时意外发现的早期怀孕母羊。

将胎儿从子宫中取出，用加了双抗的生理盐水冲洗表面，无菌手术刀切成大小为1 mm3的组织碎片，以1 500 r/min的转速离心5 min。

然后，用0.2%的I型胶原酶消化1 h，中间每10 min混匀一次，消化结束后，再次离心。

接着用0.25%胰酶消化20 min，加等量培养基（89% DMEM/F12、10% NBCS、1% PS）终止消化，用0.074 mm细胞筛进行过滤，离心，悬浮培养在100 mm细胞培养皿中，随后通过差速贴壁的方法纯化成肌细胞。

1.2.2　绵羊胎儿成肌细胞的分化与处理　绵羊胎儿成肌细胞长到80%左右时，对照组用含有2% HS和1% PS的DMEM/F12正常诱导分化48、72 h。

根据山西农业大学分子细胞调控课题组前期经验，在低浓度时，地塞米松对成肌分化有促进作用，中高浓度时对成肌分化有抑制作用。

因此，本试验中试验组的处理方式为：在正常分化的细胞中添加中浓度（0.375 mg/mL）的地塞米松，分别处理细胞48、72 h。

1.2.3　ROS检测　采用活性氧检测试剂盒检测各组成肌细胞中的ROS水平。

每孔加入4%多聚甲醛溶液固定2 min，PBS洗涤3次。

然后加入ROS 检测工作液，置培养箱20 min，洗涤细胞3次，荧光显微镜观察并分析ROS水平。

1253
山西农业科学 2023 年第 51 卷第 11 期
1.2.4　RNA -seq 分析　分别将不加地塞米松分化48、72 h 和加地塞米松分化48、72 h 的细胞样品收集放置于RNAiso Plus 裂解液中，送至百迈客公司进行转录组测序分析。

根据测序结果，分析NF -κB 和Nrf2信号通路相关基因的mRNA 相对表达情况。

1.3　生物信息学及统计学分析
采用皮尔森相关系数法分析相关性，采用SPSS 22.0单因素（ANOVA ）方差分析差异显著性；同时利用STRING 数据库分析并建立蛋白互作网络。

每个处理3个重复。

2 结果与分析
2.1　绵羊胎儿成肌细胞分离、分化及地塞米松处理后的形态和ROS 变化
分离培养的绵羊成肌细胞在2~3 d 内开始从组织块爬出，并在第3天时开始大量增殖，如图1所示，细胞形态正常，呈长梭形或者梭形，可用作后续试验。

诱导分化后，单核成肌细胞开始变长并逐渐融合为多核肌管。

地塞米松处理前后的变化如图2所示，随着分化时间延长肌管数量增加，地塞米松处理抑制了成肌细胞的分化，导致形成的肌管变短变细、数量减少。

相应地，与N 48 h 组相比，Dex 48 h 组中ROS 含量增加了130.96%，差异极显著（P<0.01）；与N 72 h 组相比，Dex 72 h 组中ROS 含量增加了151.57%，差异极显著（P<0.01）。

2.2　NF-κB 和Nrf2通路相关基因的mRNA 表达结果
由测序结果分析可知（图3），NF -κB 信号通路中，与N 48 h 组相比，Dex 48 h 组中P65、IKK2、IκBα、IκBβ、SOD2和FHC 的mRNA 相对表达量分别上升了53.68%、36.38%、219.36%、55.64%、415.32%和388.12%，差异极显著（P <0.01）；与N 72 h 组相比，Dex 72 h 组中P65、IKK2、IκBα、SOD2和FHC 的mRNA 相对表达量分别上升了45.39%、66.85%、226.32%、436.08%和339.08%，差异极显著（P <0.01），IκBβ的mRNA 相对表达量上升了47.58%，差异达显著水平（P <0.05）。

Nrf2信号通路中，与N 48 h 组相比，Dex 48 h 组中Keap1、Nrf2和HO -1的mRNA 相对表达量分别上升了83.98%、81.46%和242.02%，差异极显著（P <0.01），GSH -Px 的mRNA 相对表达量上升了54.45%，差异显著（P <0.05）。

与N 72 h 组相比，Dex 72 h 组中Keap1、SOD1和HO -1的mRNA
相
图1　绵羊胎儿成肌细胞在培养基中的生长状态
Fig.1　Growth status of sheep fetal myoblasts in
the culture medium
**表示差异极显著。

图3同
** indicated extremely significant difference. The same as Fig.3
图2　绵羊胎儿成肌细胞在加或不加Dex 的分化培养基中分化的状态（A ）和ROS 水平（B ）
Fig.2　Differentiation status （A ），ROS levels （B ）of sheep fetal myoblasts in
differentiation medium with or without Dex
1254
李君等：NF-κB 和Nrf2信号通路在成肌细胞抗氧化应激中的作用
对表达量分别上升了74.78%、37.20%和270.51%，差异达极显著水平（P <0.01）。

2.3　NF-κB 和Nrf2通路相关基因mRNA 表达的相关性
由表1可知，分化48 h 后，NF -κB 信号通路中，P65与IKK2、IκBα、IκBβ和FHC 呈极显著正相关（P <0.01）；IKK2与IκBα呈极显著正相关（P <0.01），与IκBβ、SOD2和FHC 呈显著正相关（P <
0.05）；IκBα与IκBβ和FHC 呈极显著正相关（P <0.01）；IκBβ与FHC 呈显著正相关（P <0.05）。

Nrf2信号通路中，Nrf2与SOD2呈极显著正相关（P <0.01）；HO -1与Keap1呈极显著正相关（P <0.01）。

NF -κB 信号通路和Nrf2信号通路相关性分析结果显示，Keap1与P65、IKK2、IκBα、IκBβ和FHC
呈极
NF -κB 通路包含P50、P65、IKK2、IκBα、IκBβ、SOD2基因，Nrf2通路包含Nrf2、Keap1、SOD1、SOD2、FHC 、HO -1、GSH -Px 基因。

*表示差异显著
NF -κB pathway contained P50, P65, IKK2, IκBα, IκBβ, and SOD2 genes, while Nrf2 pathway contained Nrf2, Keap1, SOD1, SOD2, FHC , HO -1, and GSH -Px genes. * indicated significant difference
图3　NF-κB 和Nrf2信号通路相关基因的相对表达量
Fig.3　Relative expression level of genes related to NF-κB 和Nrf2 signaling pathways
1255
山西农业科学 2023 年第 51 卷第 11 期
显著正相关（P<0.01）；HO-1与P65、IKK2、IκBα和FHC呈极显著正相关（P<0.01），与IκBβ呈显著正相关（P<0.05）；GSH-Px与IκBβ和FHC呈显著正相关（P<0.05）。

由表2可知，分化72 h后，NF-κB信号通路中，P50与IκBβ呈显著正相关（P<0.05）；P65与IKK2、IκBα、IκBβ和FHC呈极显著正相关（P<0.01）；IKK2与IκBα和FHC呈极显著正相关（P<0.01），与IκBβ呈显著正相关（P<0.05）；IκBα与IκBβ和FHC呈极显著正相关（P<0.01），与SOD2呈显著正相关（P<0.05）；IκBβ与FHC呈极显著正相关（P<0.01）；SOD2与FHC呈显著正相关（P<0.05）。

Nrf2信号通路中，Keap1与HO-1和GSH-Px呈极显著正相关（P<0.01），与SOD1呈显著正相关（P< 0.05）；SOD1与HO-1呈极显著正相关（P<0.01），
与SOD2呈显著正相关（P<0.05）；SOD2与HO-1呈显著正相关（P<0.05）；HO-1与GSH-Px呈极显著正相关（P<0.01）。

Nrf2信号通路和NF-κB信号通路相关性分析结果显示，Keap1与P65、IKK2、IκBα、IκBβ和FHC呈极显著正相关（P<0.01）；SOD1与P50呈极显著正相关（P<0.01），与IKK2、IκBα、IκBβ和FHC呈显著正相关（P<0.05）；HO-1与P65、IKK2、IκBα、IκBβ和FHC呈极显著正相关（P<0.01），与P50呈显著正相关（P<0.05）；GSH-Px 与P65、IKK2和IκBα呈极显著正相关（P<0.01），与IκBβ和FHC呈显著正相关（P<0.05）。

表1 分化48 h后各组相关基因mRNA表达的相关性
Tab.1 Correlation of mRNA expression of the related genes in each group after 48 h of differentiation
基因　Gene
P50
P65
IKK2
IκBα
IκBβ
Nrf2
Keap1
SOD1
SOD2
FHC
HO-1 GSH-Px
P50
1.000
0.160
0.337
0.264
0.001
0.445
0.179
0.146
0.364
-0.077
0.097
-0.518
P65
1.000
0.927**
0.993**
0.949**
0.678
0.994**
0.192
0.684
0.954**
0.970**
0.748
IKK2
1.000
0.946**
0.880*
0.789
0.946**
0.248
0.833*
0.870*
0.951**
0.618
IκBα
1.000
0.918**
0.730
0.987**
0.251
0.722
0.926**
0.965**
0.674
IκBβ
1.000
0.471
0.968**
-0.014
0.537
0.914*
0.913*
0.823*
Nrf2
1.000
0.647
0.543
0.970**
0.684
0.768
0.334
Keap1
1.000
0.152
0.670
0.935**
0.964**
0.739
SOD1
1.000
0.407
0.213
0.312
0.058
SOD2
1.000
0.717
0.794
0.422
FHC
1.000
0.974**
0.881*
HO-1
1.000
0.791
GSH-Px
1.000
注：*表示相关性显著，**表示相关性极显著。

表2同。

Note: * meant significant correlation, and ** meant extremely significant correlation. The same as Tab.2.
表2 分化72 h后各组相关基因mRNA表达的相关性
Tab.2 Correlation of mRNA expression of the related genes in each group after 72 h of differentiation
基因　Gene
P50
P65
IKK2
IκBα
IκBβ
Nrf2
Keap1
SOD1
SOD2
FHC
HO-1 GSH-Px
P50
1.000
0.763
0.758
0.766
0.853*
0.234
0.798
0.923**
0.747
0.800
0.816*
0.699
P65
1.000
0.925**
0.971**
0.937**
0.363
0.923**
0.796
0.726
0.948**
0.934**
0.960**
IKK2
1.000
0.966**
0.888*
0.310
0.991**
0.880*
0.770
0.973**
0.992**
0.942**
IκBα
1.000
0.944**
0.480
0.957**
0.869*
0.843*
0.994**
0.980**
0.928**
IκBβ
1.000
0.392
0.921**
0.850*
0.810
0.950**
0.921**
0.890*
Nrf2
1.000
0.251
0.436
0.771
0.471
0.381
0.140
Keap1
1.000
0.881*
0.754
0.970**
0.987**
0.951**
SOD1
1.000
0.897*
0.906*
0.923**
0.734
SOD2
1.000
0.870*
0.832*
0.591
FHC
1.000
0.990**
0.911*
HO-1
1.000
0.922**
GSH-Px
1.000
1256
李君等：NF-κB 和Nrf2信号通路在成肌细胞抗氧化应激中的作用
2.4　NF-κB 和Nrf2通路相关基因的蛋白互作分析结果
为了进一步了解NF -κB 和Nrf2这2条通路中氧化应激相关基因之间的关系，利用STRING 数据库分析并建立了蛋白互作网络，结果显示（图4），NF -κB 和Nrf2这2条通路的多数基因之间存在互作关系，而且2条通路之间具有交叉对话作用，其中，Keap1是联系NF -κB 和Nrf2这2条通路的关键枢纽，Nrf2（NFE2L2）和IκBα（NFκBIA ）之间的互作关系也是2条通路沟通的方式之一，而SOD2是2条通路共同调控的下游基因。

3 结论与讨论
细胞的功能会受到细胞内在损伤和外界刺激的影响，包括氧化应激、DNA 损伤、蛋白质损伤和新陈代谢改变等[13]。

在骨骼肌发育、再生以及体外研究成肌分化的过程中，不可避免地会受到氧化应激影响，适当的ROS 能够参与肌卫星细胞的激活以及成肌细胞的增殖分化，但过量增加的ROS 会导致细胞功能障碍，影响骨骼肌细胞的发育和再生[14]。

研究表明，地塞米松可以引起小鼠成肌细胞氧化应激[15]。

本研究中，通过形态学观察与ROS 检测结果发现，与正常对照组相比，地塞米松处理导致分化48 h 和72 h 的绵羊成肌细胞内ROS 含量显著上升，成肌细胞出现受损，分化和融合成肌管的数目减少，肌管的直径变小，表明成肌分化过程中的氧化应激模型成功构建。

其原因可能是由于地塞米松引起的氧化应激会抑制成肌细胞内蛋白质的合成，促进肌管内蛋白质的降解[16]，从而影响成肌细胞的分化及融合过程。

NF -κB 蛋白家族作为一种多效性的转录因子，在调节细胞凋亡、炎症反应、应激反应、免疫应答中发挥着重要的生物学功能[17-18]。

该家族中P65和
P50构成的异二聚体属于典型的诱导型[19]，正常情况下，其与抑制蛋白IκB 形成三聚体存在于细胞质中。

当受到刺激后，会激活IκB 激酶的亚型IKK2，使IκB 发生降解，P65和P50得以进入核内启动SOD2和FHC 等下游基因的表达[20]。

作为一种超氧化物清除的关键酶，SOD2的主要作用是清除氧化磷酸化产物超氧阴离子自由基[21]。

FHC 编码的铁蛋白可以将细胞内的铁储存起来以限制芬顿反应的发生，使细胞中的ROS 含量减少[22]。

本试验中，Dex 48 h 组和Dex 72 h 组分别与对照相比发现，NF -κB 通路中IKK2、P65、IκBα、IκBβ、SOD2、FHC 的mRNA 表达水平均呈极显著升高，表明ROS 激活了NF -κB 通路，继而促进了下游靶基因SOD2和FHC 的表达，其中部分原因是由IKK2、P65基因表达量的升高所致。

同时，抑制因子IκB mRNA 的表达也出现了显著上升，其原因可能是IκB 也属于NF -κB 的下游靶基因，该转录因子的活化或表达增加会直接调控IκB 的表达，使其表达上调从而反馈性抑制NF -κB 的过度活化[23-24]。

通过
对各基因之间mRNA 表达的相关性分析结果可知，分化48、72 h 时NF -κB 通路相关基因随地塞米松处理表现出的表达相关性存在一致性也存在差异性。

2个阶段中P65与IKK2、IκBα、IκBβ和FHC 均存在显著相关性，而IKK2、IκBα、IκBβ和FHC 相互之间多数存在显著相关，但2个阶段有所差异，此外，2个阶段中与SOD2呈现显著相关的基因有所不同。

Nrf2通路是抗氧化应激的主要机制之一。

YANG 等[25]研究发现，香叶素能够通过激活Nrf2/HO -1通路来减轻氧化应激，从而预防脑缺血/再灌注损伤。

李孟心等[26]证明了Nrf2/HO -1信号通路在H 2O 2诱导的hiPSCs 氧化应激中发挥了明显的抗氧化作用。

正常情况下，细胞内的Nrf2与Keap1结合，以非活性的形式存在。

当发生氧化应激后Nrf2与Keap1发生解离并转移至细胞核内，与Maf 蛋白形成异二聚体后，通过与250多个基因启动子区域中存在的抗氧化反应元件（ARE ）序列结合，来启动一系列抗氧化基因的转录，其中包括HO -1、SOD 和GSH -Px 等[27-28]。

本试验研究表明，与对照相比，处理组HO -1、SOD1、SOD2和GSH -Px mRNA 的表达量多数达到显著上升，至少部分是由于Nrf2表达上调介导的。

HO -1、SOD 、GSH -Px 表达增加后，分别主要通过阻止血红素基团促氧化[29]、清除氧化磷酸化产物超氧阴离子自由基[21]、
分解有毒的
图4　NF-κB 与Nrf2通路相关基因的蛋白互作网络
Fig.4　Protein-protein interaction （PPI ）network of
genes related to NF-κB and Nrf2 pathways
1257
山西农业科学 2023 年第 51 卷第 11 期
过氧化物[30-31]等作用而减缓ROS对绵羊成肌细胞分化的不利影响。

同时，抑制因子Keap1 mRNA的表达也出现了显著上升，这与上述NF-κB通路中抑制因子IκB mRNA表达上升的机制可能是类似的，是机体的一种负反馈调节。

通过对各基因之间mRNA表达的相关性分析结果可知，分化48、72 h 时Nrf2通路相关基因随地塞米松处理表现出的表达相关性同样存在异同。

其中，Keap1、SOD1、SOD2、HO-1、GSH-Px之间，多数基因在48 h或（和）72 h表现出相关性，而Nrf2的表达与SOD2存在相关性。

当细胞受到氧化应激时，多种信号通路被激活参与抗氧化应激，这些通路之间也存在相互作用。

本试验进一步对NF-κB和Nrf2这2条通路基因的表达相关性以及蛋白互作关系进行分析可知，尽管有些基因之间的表达相关性不显著，但这2条通路各基因之间存在调控关系。

因为基因的mRNA转录往往同时受到多个相关转录因子的调控以及其他因素的影响。

李慧[32]研究发现，NF-κB 的抑制蛋白IκB可以抑制NF-κB通路并活化Nrf2通路，表明细胞内这2条通路之间存在相互作用，这与本研究结果基本一致。

SOD2是2条通路共同调控的下游基因。

本试验中，SOD2基因可能同时受到转录因子Nrf2和P65的调控，而且受到其他相关基因的影响，因此它的表达水平是受到各因子调控或影响的综合结果。

Nrf2通路中的关键抑制因子Keap1是一种上游蛋白，参与不同信号通路的协调，在Nrf2与NF-κB信号通路之间发挥着重要的作用[33]。

综上可见，无论是分化48 h还是72 h时，Keap1与NF-κB通路相关基因P65、IKK2、IκBα、IκBβ和FHC的相关性均为显著。

结合蛋白互作关系进一步表明，Keap1基因是联系NF-κB和Nrf2这2条通路的关键枢纽。

说明在绵羊成肌细胞分化过程中，NF-κB和Nrf2信号通路被激活，其上游基因P65、IKK2、IκBα、IκBβ、Nrf2、Keap1以及相应下游靶基因SOD1、SOD2、FHC、HO-1、GSH-Px的mRNA 相对表达量均显著升高，2条通路以Keap1因子为重要枢纽而交互联系，共同在地塞米松诱导的氧化应激中发挥抗氧化作用，从而降低细胞的氧化应激损伤，减缓氧化应激对成肌分化造成的影响。

参考文献：
［1］SOHAL R S，ALLEN R G. Oxidative stress as a causal factor
in differentiation and aging：a unifying hypothesis[J]. Experimen⁃tal Gerontology，1990，25（6）：499-522.
［2］LI D J，SHEN L，ZHANG D，et al. Ammonia-induced oxidative stress triggered proinflammatory response and apoptosis in pig lungs[J]. Journal of Environmental Sciences，2023，126：683-696.［3］ESPINOSA-DIEZ C，MIGUEL V，MENNERICH D，et al.
Antioxidant responses and cellular adjustments to oxidative stress [J]. Redox Biology，2015，6：183-197.
［4］PHAM C G，BUBICI C，ZAZZERONI F，et al. Ferritin heavy chain upregulation by NF-kappaB inhibits TNFalpha-induced apoptosis by suppressing reactive oxygen species[J]. Cell，2004，119（4）：529-542.
［5］CHANG Q Q，CAI H A，WEI L L，et al. Chitosan oligosaccha⁃rides alleviate acute heat stress-induced oxidative damage by ac⁃tivating ERK1/2-mediated HO-1 and GSH-Px gene expression in breast muscle of broilers[J]. Poultry Science，2022，101（1）：101515.
［6］SCHMIDT M，SCHÜLER S C，HÜTTNER S S，et al. Adult stem cells at work：regenerating skeletal muscle[J]. Cellular and Molecular Life Sciences，2019，76（13）：2559-2570.
［7］WU P F，ZHOU K Z，ZHANG J，et al.Identification of crucial circRNAs in skeletal muscle during chicken embryonic develop⁃ment[J]. BMC Genomics，2022，23（1）：330.
［8］WANG J W，CHEN F，ZHU S H，et al. Adverse effects of pre⁃natal dexamethasone exposure on fetal development[J]. Journal of Reproductive Immunology，2022，151：103619.
［9］郭田燕，李俊玲，王鹤洁，等. 地塞米松对胎鼠骨骼肌发育相关基因表达的影响[J]. 山西农业科学，2021，49（9）：1035-1039.
GUO T Y，LI J L，WANG H J，et al. Effects of dexamethasone on expression of skeletal muscle development related genes in fe⁃tal mice[J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences，2021，49（9）：1035-1039.
［10］CHEN C，YANG J S，LU C C，et al. Effect of quercetin on dexamethasone-induced C2C12 skeletal muscle cell injury[J].
Molecules，2020，25（14）：3267.
［11］CASTILLERO E，ALAMDARI N，LECKER S H，et al. Sup⁃pression of atrogin-1 and MuRF1 prevents dexamethasone-
induced atrophy of cultured myotubes[J]. Metabolism，2013，62
（10）：1495-1502.
［12］SINGH S P，KUMAR R，KUMARI P，et al. An alternate pro⁃tocol for establishment of primary caprine fetal myoblast cell
culture：an in vitro model for muscle growth study[J]. In Vitro
Cellular & Developmental Biology-Animal，2013，49（8）：589-597.
［13］赵森. Meox1调节成肌细胞分化、肌管融合与PKA-NFAT信号通路的关联研究[D]. 十堰：湖北医药学院，2021.
ZHAO S. Meoxl regulates skeletal muscle MyOGenic cell dif⁃
ferentiation/fusion through PKA-NFAT pathway[D]. Shiyan：Hubei University of Medicine，2021.
［14］LONG X Y，GAO Y F，LIU W W，et al. Natural flavonoid silibinin promotes the migration and myogenic differentiation of
murine C2C12 myoblasts via modulation of ROS generation
and down-regulation of estrogen receptor α expression[J]. Mo⁃
lecular and Cellular Biochemistry，2020，474（1）：243-261.［15］ULLA A，UCHIDA T，MIKI Y，et al. Morin attenuates dexamethasone-mediated oxidative stress and atrophy in mouse
1258
李君等：NF-κB和Nrf2信号通路在成肌细胞抗氧化应激中的作用
C2C12 skeletal myotubes[J]. Archives of Biochemistry and
Biophysics，2021，704：108873.
［16］LU L，WANG D T，SHI Y，et al. Astragalus polysaccharide improves muscle atrophy from dexamethasone-and peroxide-
induced injury in vitro[J]. International Journal of Biological
Macromolecules，2013，61：7-16.
［17］TANIGUCHI K，KARIN M. NF-κB，inflammation，immunity and cancer：coming of age[J]. Nature Reviews Immunology，2018，18（5）：309-324.
［18］OECKINGHAUS A，GHOSH S.The NF-kappaB family of transcription factors and its regulation[J]. Cold Spring Harbor
Perspectives in Biology，2009，1（4）：a000034.
［19］NENNIG S E，SCHANK J R. The role of NFkB in drug ad⁃diction：beyond inflammation[J]. Alcohol and Alcoholism，2017，52（2）：172-179.
［20］IKEGAMI Y，INUKAI K，IMAI K，et al. Adiponectin upregu⁃lates ferritin heavy chain in skeletal muscle cells[J]. Diabetes，2009，58（1）：61-70.
［21］TSAI Y T，YEH H Y，CHAO C T，et al. Superoxide dis⁃mutase 2（SOD2）in vascular calcification：a focus on vascular
smooth muscle cells，calcification pathogenesis，and therapeutic
strategies[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2021，2021：6675548.
［22］YOU L H，LI Z，DUAN X L，et al. Mitochondrial ferritin sup⁃presses MPTP-induced cell damage by regulating iron metabo⁃
lism and attenuating oxidative stress[J]. Brain Research，2016，1642：33-42.
［23］高琳，陈静，戴云峰. 子宫内膜癌患者CerbB-2、NF-κB P50、MIF和IκBα蛋白表达水平与疾病严重程度的相关性研究[J].
中国肿瘤临床与康复，2020，27（8）：909-912.
GAO L，CHEN J，DAI Y F. Correlation between expression
levels of Cerb B-2，NF-κB P50，MIF and IκBα and disease se⁃
verity in patients with endometrial cancer[J]. Chinese Journal
of Clinical Oncology and Rehabilitation，2020，27（8）：909-912.［24］GUPTA A，BROOKS C，STOREY K B. Regulation of NF-κB，FHC and SOD2 in response to oxidative stress in the
freeze tolerant wood frog，Rana sylvatica[J]. Cryobiology，2020，97：28-36.
［25］YANG Y，HE B，ZHANG X C，et al. Geraniin protects against cerebral ischemia/reperfusion injury by suppressing oxi⁃
dative stress and neuronal apoptosis via regulation of the Nrf2/
HO-1 pathway[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2022，2022：2152746.
［26］李孟心，张枫惠，韩高链，等. Nrf2/HO-1信号通路在人诱导性多能干细胞氧化应激中的作用[J]. 中国生物化学与分子生
物学报，2019，35（7）：794-802.
LI M X，ZHANG F H，HAN G L，et al. The role of the Nrf2/
HO-1 signal pathway in oxidative stress of human induced plu⁃
ripotent stem cells[J]. Chinese Journal of Biochemistry and Mo⁃
lecular Biology，2019，35（7）：794-802.
［27］CUADRADO A，MANDA G，HASSAN A，et al. Transcrip⁃tion factor NRF2as a therapeutic target for chronic diseases：a
systems medicine approach[J]. Pharmacological Reviews，2018，70（2）：348-383.
［28］BRONISZ-BUDZYŃSKA I，KOZAKOWSKA M，PIETRAS-ZEK-GREMPLEWICZ K，et al. NRF2 regulates viability，pro⁃
liferation，resistance to oxidative stress，and differentiation of
murine myoblasts and muscle satellite cells[J]. Cells，2022，11
（20）：3321.
［29］JAIS A，EINWALLNER E，SHARIF O，et al. Heme oxygen⁃ase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse
and man[J]. Cell，2014，158（1）：25-40.
［30］WANG F J，LI R Y，TU P F，et al. Total glycoside s of Cis⁃tanche deserticola promote neurological function recovery by in⁃
ducing neurovascular regeneration via nrf-2/keap-1 pathway in
MCAO/R rats[J]. Frontiers in Pharmacology，2020，11：236.［31］GOC Z，SZAROMA W，KAPUSTA E，et al. Protective ef⁃fects of melatonin on the activity of SOD，CAT，GSH-Px and
GSH content in organs of mice after administration of SNP[J].
The Chinese Journal of Physiology，2017，60（1）：1-10.
［32］李慧. NF-κB通路负调控Keap1-Nrf2通路及其分子机制研究[D].天津：天津大学，2009.
LI H. Research on NF-κB pathway negative regulation Keap1-
Nrf2 pathway and its molecular mechanism[D]. Tianjin：Tian⁃
jin University，2009.
［33］李振喜. keap1-Nrf2与NF-κB信号通路相关性研究进展[J].
医学研究杂志，2018，47（4）：14-18.
LI Z X. Research progress on correlation between keap1-Nrf2
and NF-κB signaling pathway[J]. Journal of Medical Research，2018，47（4）：14-18.
1259。