大肠杆菌的分离和培养PPT课件

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2、涂布分离法
1) 稀释菌液 （10-5 ~ 10-7倍）
用无菌吸管吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有 9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的 稀释液。……
3) 涂布
用无菌吸管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培 养皿的固体培养基上。再将玻璃刮刀放在酒精灯火 焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿， 将菌液涂布到整个平面上。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
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四、大肠杆菌的培养和分离
1、大肠杆菌 （1）特性：
革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌 （2）用途：
基因工程技术中被广泛采用的工具
2、培养： LB液体培养基 —— 扩大培养 LB固体培养基 —— 分离
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液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
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沉淀生长
固体培养基：菌落
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（2）根据化学成分分
合成培养基——成分明确 天然培养基——成分不明确
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（3）按培养基的用途分类
• a．基础培养基（LB培养基）:含有一般细菌生 长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础 培养基是上面提及的天然培养基中的牛肉膏蛋 白胨培养基。
• b．营养培养基（加富培养基）:在基础培养基 中加入某些特殊营养物质，如血液、血清或生 长因子等。用以培养对营养要求高的微生物。
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c、选择培养基——在培养基中加入某种化学物 质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要 的微生物的生长,如 尿素固体培养基可以分离以尿素为氮源的微 生物。
操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环 上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼 烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上 残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种 直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数 的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以 便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和 感染操作者。
微生物需要的五大类营养要素物质 碳源 氮源 生长因子 无机盐 水
培养基（培养液）是人工方法配制而成的， 是微生物生存的环境和营养物质。
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1）培养基的成分 （a）细菌培养基： 特殊成分：蛋白胨、酵母提取液、氯化钠 酸碱度：中性偏碱 （b）霉菌培养基： 特殊成分：无机物或添加蔗糖的豆芽汁 酸碱度：中性偏酸
d、鉴别培养基——在培养基中加入某种指示剂 或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,如 伊红和美蓝,和大肠杆菌的代谢产物结合,使 菌落呈深紫色,并带有金属光泽,可以用来鉴 别大肠杆菌
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二、无菌操作技术
1、概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所
有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到 的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布 法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”， 即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌 操作，才可能成功地培养微生物。
（a）消毒：
1）对接种室、接种箱或超净工作台先用 紫外线 进行物理消毒，然后用 酒精 增强消毒效果。 2）实验操作者的双手使用 酒精 进行消毒。
3）日常生活经常用到的是煮沸消毒法。 4）对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法。
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巴氏消毒法是法国科学家巴斯德创建的一 种食品保鲜方法，最早是为了延长法国葡萄酒 的保质期。这是一种能将绝大多数的细菌杀死 的低温消毒方法。
3.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿 盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生 物吗？为什么？
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养 基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
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1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需 要灼烧接种环吗？为什么？
牛奶消毒也用巴氏消毒法。
具体措施：牛奶在62.8摄氏度下30分钟。
优点：最大限度地保持了牛奶的品质，颜 色，味道和营养。
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(b)灭菌：
1）灼烧灭菌
接种环、玻璃刮刀 试管口
2）高压蒸气灭菌： 1kg/cm2压力、121℃、15min
培养皿、试管、三角瓶、取样器的头、移液管、 三角刮刀、接种环、镊子、无菌水、培养基
高压蒸汽灭菌不会破坏培养基的营养成分。
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三、分离细菌方法
1、划线分离法（P20）
（视频）
1）灼烧接种环；
2）接种环冷却后，蘸取带菌培养物
3）在近火焰处，让带菌接种环在固体培养
基上划线。
划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的 都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形 成单个菌落。
图1-3 细菌的结构
繁殖方式：分裂繁殖（20min分裂一次）
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2、菌落：
• 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时， 就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结 构的子细胞群体，叫做菌落。
• 菌落是鉴定菌种的重要依据。
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菌落
细菌的菌落特征因种 而异
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3、培养基
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1.培养基灭菌后，需要冷却到60 ℃左右时，才能 用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的 温度下降到刚刚不烫手时，就可进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
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2、无菌技术包括： （1）对实验操作空间、操作者的衣着 和手进行 清洁和消毒 ； （2）将培养器皿、接种用具和培养基 等器具进行 灭菌 ； （3）为避免周围微生物污染，实验操 作应在 酒精灯火焰附近 进行； （4）避免已灭菌处理的材料用具 与 周围物品 相接触。
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菌种保存 用接种环取单菌落，用划线法接种于斜面上，在37℃ 的恒温培养箱中培养24h，再放入4℃的冰箱中保存 。 第27页/共36页
倒平板技术
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微生物的恒温培养
微生物的恒温培养
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微生物的恒温培养
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菌种的保存 接种到固体斜面培 养基，菌落长成后 置于4℃冰箱保存。
一、微生物
指结构简单,形体微小的单细胞、多细胞或 无细胞结构的低等生物。
微生物的类群
病毒 细菌 蓝细菌 放线菌 酵母 霉菌 原生动物
病毒 原核生物
真菌 原生动物
90%以上的微生物是对人类有利的。
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1、细菌的构造
细菌细胞由外向里依次有: 鞭毛和菌（纤）毛 荚膜 细胞壁 细胞膜 细胞质 拟核区(类核区)
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3、分离 培养基灭菌 将LB液体和固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌
制作平板
将灭菌后冷却到60℃的LB固体培养基倒入灭菌过的培 养皿中，制作平面培养基.
扩大培养 将大肠杆菌从斜面接种到LB液体培养基中，然后在 37℃摇床中震荡培养12h。
划线分离
用接种环取震荡培养后的菌液，并在固体培养基上划 线，然后将划线后的培养皿倒置与37℃的恒温培养箱 中培养12~24h，观察划线末端的菌落生长情况.
4) 培养
将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24~48h。
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1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物 被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
答：无菌技术还能有效避免操作者自 身被微生物感染。
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭 菌。如果需要，请选择合适的方法。
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2）培养基的种类
（1）按物理性质分:
a.固体培养基 通常加琼脂，作为凝固剂 （凝固剂的要求：不被微生物利用，又可使培养基
固化，且不影响培养基中的其他营养物被细菌吸收） 作用：分离（纯化）细菌、计数、保留菌种等
b.液体培养基 不加琼脂等凝固剂其它成分与固体培养基相同 作用：培养细菌
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3、消毒与灭菌的概念及两者的区别 （1）消毒定义： 利用化学或物理方法，杀死大部份
致பைடு நூலகம்微生物的过程。
（2）灭菌的定义： 以化学或物理方法消灭所有微生物，
包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病 毒，而达到完全无菌的过程。
灭菌与消毒技术是微生物有关工作中 最普通也是最重要的技术。
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（3）具体无菌处理方法：
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2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却 后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什 么总是从上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处 要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌 的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能 得到由单个细菌繁殖而来的菌落。