人脐血间充质干细胞在脑瘫大鼠脑内定植和存活能力的研究

[收稿日期]2016⁃04⁃11
[基金项目]江苏省连云港市科技局重点科室建设(SH1117)[作者单位]江苏省连云港市第一人民医院儿内科,222000[作者简介]杨自金(1967-),男,硕士研究生导师,主任医师.
[文章编号]1000⁃2200(2016)08⁃0985⁃04
㊃基础医学㊃
人脐血间充质干细胞在脑瘫大鼠脑内定植和存活能力的研究
杨自金,卢思广,高长龙,郭佳丽,苗　莉,李红梅
[摘要]目的:通过侧脑室注射,观察人脐血间充质干细胞(MRCs)在脑瘫(CP)大鼠脑内的存活㊁迁移㊁分化情况㊂方法:用腹腔注射脂多糖方法制作CP 大鼠模型14只,将标记过的MSCs 经侧脑室注射到12只CP 大鼠脑内,观察在注射1~4周后MSCs 在脑内存活㊁迁移㊁分化情况;2只不进行注射的CP 大鼠作空白对照㊂结果:腹腔注射脂多糖方法成功制作CP 模型;MSCs 鉴定成功;MSCs 经侧脑室注射能在CP 大鼠脑内存活㊁迁移,并分化成神经细胞,随移植时间推移,有减少趋势(P <
0.01)㊂2只未注射模型大鼠未检测到MSCs 阳性细胞㊂结论:MSCs 能在CP 大鼠脑内定植,随着时间推移,数量明显减少㊂[关键词]脑瘫;脐血间充质干细胞;定植;大鼠
[中图法分类号]R 742 [文献标志码]A DOI :10.13898/ki.issn.1000⁃2200.2016.08.002
Study of the colonizing and survivability of human umbilical cord blood
mesenchymal stem cells in brain of rats with cerebral palsy
YANG Zi⁃jin,LU Si⁃guang,GAO Chang⁃long,GUO Jia⁃li,MIAO Li,LI Hong⁃mei
(Department of Pediatrics ,The First Hospital of Lianyungang ,Lianyungang Jiangsu 222000,China )
[Abstract ]Objective :To explore the viability,migration and differentiation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells
(MSCs)in brain of rats with cerebral palsy(CP)after the lateral ventricle injection.Methods :Fourteen CP model rats were established by the intraperitoneal injection of lipopolysaccharide,and the labeled MSCs were injected into the lateral ventricle in 12CP rats.The viability,migration and differentiation of MSCs in rat brain were observed after 1to 4weeks of injection.Other two rats without injecting were set as the control group.Results :The CP model rats were successfully established by the intraperitoneal injection of lipopolysaccharide,and the MSCs were identified.The colonizing MSCs could survive,migrate and differentiate into neurons,and which
decreased with the transplanting time extending(P <0.01).The positive MSCs was not explored in two rats without the MSCs injecting.Conclusions :MSCs can survive in brain of rats with CP,and the number of which decrease with the time extending.[Key words ]cerebral palsy;human umbilical cord mesenchymal stem cells;colonizing;rat
脑瘫是脑性瘫痪(cerebral palsy,CP)的简称,是严重危害儿童身心健康的疾病,目前主要治疗措施为脑细胞活性药物及康复治疗[1],但对已死亡的脑细胞无再生效果,探讨新的治疗方案已成为当前人们研究热点㊂人脐血间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于脐血的单个核细胞,具有多向分化潜能,在体外有向造血细胞㊁成骨细胞㊁脂肪细胞和神经细胞等分化的能力㊂与骨髓相比,脐血取材方便㊁来源充足;MSCs 免疫原性较弱,是一种新型的㊁优良的细胞移植种子来源[2]㊂本研究观察MSCs 在CP 大鼠脑内的定植情况,为MSCs 治疗CP 提供实验依据㊂1　材料与方法
1.1　材料　成年SD 大鼠12只(徐州医学院动物
所,清洁级,母鼠9只,公鼠3只,体质量200~300
g),MSCs (江苏省博雅干细胞库馈赠)㊂试剂:Mesencult TM 细胞培养液,5⁃溴脱氧嘧啶尿苷(BrdU,Sigma);FITC 标记大鼠抗BrdU 抗体(ABCAM);PE 标记小鼠抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(Millipore);兔抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体(ABCAM)作为一抗,PE 标记羊抗兔IgG⁃Cy3
(Millipore)作为二抗;小鼠抗人CD34㊁CD44㊁CD29㊁CD105㊁CD45(eBioscience)抗体㊂主要仪器:立体定向仪,超净工作台,细胞培养箱,Olympus 倒置相差显微镜,EUROSTAR IIIPLUS 型荧光显微镜,FACS Canto 流式细胞仪,10μL 微量进样器等㊂
1.2　方法　
1.2.1　脐血MSCs 的培养㊁鉴定和标记[3]　将获赠的P2代人脐血MSCs 进行贴壁培养,采用Mesencult TM 培养基进行培养,并调整其pH 值呈偏酸性,置37℃㊁体积分数为5%的CO 2㊁饱和湿度的培养箱中培养㊂1周后更换培养基,弃掉未贴壁细胞㊂以后每3d 换液1次㊂细胞长到80%融合时,
5
89蚌埠医学院学报2016年8月第41卷第8期
用1∶1的2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L EDTA混合消化,以8.0×103/cm2的密度接种于传代培养瓶(T⁃25)中进行扩增培养,移植前72h加入BrdU 20μmol/L进行标记㊂移植前用0.3%胎盼蓝检测细胞活力,调整浓度至5×104/μL备用,用于细胞移植㊂取传第3代的脐血MSCs,去掉培养液,PBS 洗2遍,用1∶1的2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L EDTA混合液消化,用含20g/L BSA的PBS洗涤后制成浓度为1×106/mL的单细胞悬液,每个Eppendoff管加50μL细胞悬液,并分别加入小鼠抗人CD34㊁CD44㊁CD29㊁CD105㊁CD45抗体各10μL,阴性对照管加FITC标记的兔抗鼠IgG及PE标记的兔抗鼠IgG抗体各10μL,4℃孵育30min,PBS洗涤后用流式细胞仪分析㊂
1.2.2　CP大鼠模型制作及鉴定　受孕17d孕鼠腹腔注射脂多糖0.4mg㊃kg-1㊃d-1,连续注射2d,放回笼中饲养,孕鼠自体分娩,生下乳鼠同笼饲养,生后4周,通过神经行为学功能评估[4],鉴定为CP 的大鼠,必须同时具备神经行为学检查中随意运动障碍㊁姿势异常㊁肌张力异常㊁倾斜板试验必须有一项是阳性㊂筛选CP模型动物14只,其中12只做侧脑室注射MSCs,2只作为空白对照,不进行侧脑室注射㊂
1.2.3　侧脑室注射[5]　将CP模型组幼鼠用乙醚麻醉,固定于立体定位仪上,头部常规备皮消毒,无菌操作下作头皮矢状切口㊁钻孔㊂注射部位为左侧侧脑室:AP⁃3.5mm,ML⁃3mm,DV⁃4mm㊂通过微量注射器,每个位点注射10μL神经干细胞(细胞数约5×105),均匀缓慢注入,退针前停针5min㊂1.2.4　免疫荧光染色分析　移植组在7㊁14㊁21㊁28d时间点各取2只大鼠,将大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,给予10%甲醛心脏灌注,取脑㊂标本按常规给予固定㊁浸泡㊁脱水㊁浸蜡㊁包埋,制作石蜡切片,采用冠状切片,切片厚度为5μm,每5张切片中取同一切面中连续的2张切片㊂用直接免疫荧光方法进行组织学染色鉴定BrdU及GFAP阳性细胞:FITC标记大鼠抗人Brdu抗体(1∶400),PE标记小鼠抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(1∶400),荧光显微镜下计数,随机计算10个视野,计算平均数;用间接免疫荧光方法检测NSE阳性细胞:兔抗人NSE抗体(1∶400),PE标记羊抗兔IgG⁃Cy3 (1∶50)㊂
1.3　统计学方法　采用方差分析和q检验㊂2　结果
2.1　脐血MSCs的培养及鉴定　复苏后细胞生长旺盛,呈形态及大小均一的小长梭形细胞(见图1),
折光强,倍增时间为5~9d,约1周融合㊂细胞传3代后,做MSCs表面标志性抗原检测㊂应用流式细胞仪进行检测,结果显示脐血MSC高表达CD29 (68.2%)㊁CD44(52.2%)和CD105(65.7%)表面标志抗原,低表达CD34(3.6%)和CD45(1.0%)表面标志抗原,符合间充质干细胞特征㊂
2.2　培养细胞免疫荧光结果　Brdu标记脐血MSCs72h,细胞爬片后,应用直接免疫荧光法检测Brdu阳性细胞率,大部分细胞核被染成绿色,阳性率为93%(见图2),说明培养的MSCs标记成功㊂2.3　MSCs移植组脑实质BrdU阳性细胞迁移㊁分布㊁分化情况　应用免疫荧光单标染色,在荧光显微镜下,可见FITC标记的BrdU阳性细胞㊂MSCs移植后大鼠脑实质BrdU阳性细胞主要分布在大脑皮质区㊁海马㊁脑室周围,有局部聚集现象,白质区㊁基底核㊁丘脑区可见少量BrdU阳性细胞㊂移植后第7天大鼠脑组织内可见较多BrdU阳性细胞(28.3±6.28),主要聚集在大脑皮质㊁侧脑室及嗅球,左侧(移植侧)多于右侧;第14天BrdU阳性细胞(20.6±
3.65)㊁第21天BrdU阳性细胞(13.7±3.88)逐渐减少,主要分布在海马㊁侧脑室旁㊁基底核,第28天BrdU阳性细胞(6.3±2.11)仅见少量细胞存活㊂移植后第7~28天大鼠脑组织中BrdU阳性细胞差
异均有统计学意义(F=49.05,P<0.01,MS
组内= 18.067),并随着时间推移,BrdU阳性细胞逐渐减少(P<0.01)㊂未注射MSCs CP大鼠脑内未检测到BrdU阳性细胞㊂因GFAP抗体及NSE抗体一抗均为抗人抗体,大鼠自身GFAP㊁NSE阳性细胞不显影,GFAP㊁NSE分别存在于星形胶质细胞㊁神经元细胞中,故GFAP㊁NSE阳性细胞可视为移植细胞分化的星形胶质细胞㊁神经元细胞㊂移植7d,偶见GFAP㊁NSE阳性细胞,移植14d㊁28d可见到相对多GFAP㊁NSE阳性细胞,但28d时明显减少,因数量较少,未做统计学处理(见图3~6)㊂未注射MSCs CP大鼠脑内未检测到GFAP㊁NSE阳性细胞,说明注射后CP大鼠脑内GFAP㊁NSE阳性细胞,为移植细胞分化后的成熟细胞,而非大鼠自身细胞㊂
3　讨论
目前CP模型制作方法有3种[4]:(1)缺血缺氧
689J Bengbu Med Coll,August2016,Vol.41,No.8
因素所致,单侧颈总动脉结扎结合低氧环境制作CP 模型;(2)宫内感染因素所致,通过腹腔注射脂多糖引起孕鼠早产制作CP 模型;(3)胆红素所致,通过腹腔注射胆红素引起孕鼠早产制作CP 模型㊂其中方法(1)操作简单,易成功,方法(2)(3)操作相对复杂,成功率相对低,主要是注射剂量的把握㊂本实验采用脂多糖0.4mg㊃kg -1㊃d -1,连续2d 腹腔注射,出生后死亡较多,但成活的早产鼠符合CP 标准的较多,与报道略不同,可能与注射剂量偏大有关㊂
MSCs 是来源于发育早期中胚胎层的一类多能
干细胞,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,骨髓组织中较为丰富,近期研究脐带血中存在MSCs,其体外扩增能力㊁细胞原始性均高于骨髓,并可向神经细胞分化,证明脐血中确实含有MSCs,并有很强的可塑性
[6-8]
㊂本实验中我们获得的脐血MSCs,在
形态上为成纤维细胞样细胞群,增殖较为活跃,随着传代的增加,其中混杂的异质细胞逐渐消失,获得单一的MSCs㊂本实验脐血MSC 高表达抗原标志CD29㊁CD44和CD105表面标志,低表达CD34和CD45表面标志,与骨髓来源MSCs 相似㊂
本实验将BrdU 标记的脐血MSCs 移植到CP 模
型大鼠侧脑室内,免疫荧光染色发现,BrdU 阳性细胞主要分布于大脑皮质㊁侧脑室㊁基底核㊁海马等位置,并可迁移至对侧,部分表达星形胶质细胞及神经元标志,表明MSCs 可在CP 大鼠脑内存活㊁迁移㊁分化,定植在CP 大鼠脑组织内,与相关报道
[9-13]
大致
一致㊂至于MSCs 如何通过血脑屏障㊁进行迁移并发挥作用,目前详细机制尚不明确,推测机制可能为:脑损伤后血脑屏障破坏,MSCs 得以通过;脑损伤
后损伤部分分泌一些趋化因子,有利于向损伤部位迁移;移植细胞部分代替损伤细胞;移植细胞通过分泌细胞营养因子,促进损伤细胞恢复;刺激脑内原有神经干细胞分化发等㊂
MSCs 具有低免疫原性,不易被HLA 不相容受
体识别,故MSCs 细胞可应用于异源性或异种的移植治疗,脐血MSCs 移植为神经系统损伤或发育缺陷疾病提供了广阔的治疗前景[14-15],极大地推动了神经损伤的细胞治疗,开辟了神经损伤治疗的新领域,具有重要的临床应用价值和前景,值得更进一步的深入研究和探讨㊂与此同时,也面临很多难题,如宿主对移植细胞分化后是否存在排斥反应㊁移植细胞是否有致瘤性㊁具体作用机制㊁长期疗效如何等,有待于进一步研究㊂
[
参
考
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(下转第991页)
效的吸入麻醉药㊂虽然本研究取得了一定的进展,但对于临床中患者的个体差异㊁术中操作控制㊁七氟烷的浓度及作用时间等问题尚须作进一步深入的研究,以便更好地应用于临床㊂
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(本文编辑　刘璐)。