2010-第14章基因重组和基因工程 PPT课件

目录
Promega
Polylinker
MCS: multiple cloning site
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真 核 表 达 载 体 示 例
Invitrogen
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噬菌体 载体
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粘性质粒(cosmid) 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
目录
内
容
一、自然界DNA重组和基因转移 二、重组DNA技术 三、重组DNA技术与 医学
目录
常用的工具酶
限制性核酸内切酶
逆转录酶 T4DNA连接酶
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限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,
RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其
周围切割双链DNA的一类内切酶。
二、重组DNA技术基本原理
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基 因 克 隆 过 程 示 意 图
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以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
（一）目的基因的获取
1. 化学合成法 2. 基因组DNA(genomic DNA library酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
HindⅡ Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
目录
目录
DNA连接酶(DNA ligase)
5’
O
3’
3’
O P OO-
HO
ATP
5’
DNA连接酶
ADP 5’ 3’ 3’
O O P OO-
5’
目录
目录
目录
（五）重组体的筛选
抗药性 标志补救(marker rescue) 原位杂交 免疫方法
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α 互 补
利用α互补原理筛选重组体pUC18
原 位 杂 交
免疫学方法
鸡的β肌球蛋白的克隆和检出
（六）克隆基因的表达
原核表达体系（细菌）： 优点：培养方法简单，迅速、经济又 适合大规模生产工艺，经验丰富 不足： 只用于表达cDNA 不能进行翻译后修饰 易形成不溶性包涵体
第14章
基因重组和基因工程
Genetic Recombination and Genetic Engineering
目录
内
容
一、自然界DNA重组和基因转移 二、重组DNA技术 三、重组DNA技术与 医学
目录
DNA重组 同源重组 (homologous recombination)
接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation)
Holiday中间体
3´ 5´ 5´ 3´
5´ 3´ 3´ 5´
Holiday中间体
3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´
3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´
内切酶 (ruvC)
5´ 3´ 3´ 5´
内切酶 (ruvC)
3´ 5´
3´ 5´
3´ 5´
5´ 3´
DNA 连接酶
3´
5´ 3´
5´ 3 ´
5´
目录
限制酶切位点
cos L R cos
真核生物染 色体DNA
限制酶消化
cos L 左臂
限制酶部分消化
除去中间片段
R cos 右臂
~20 Kb DNA 片段
外源DNA与载体DNA混合
cos L ~20 Kb 外源 DNA 片段 R cos
连接反应
体外包装因与载体连接
单酶切克隆
GGATCC CCTAGG
Bam HⅠ切割反应
G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG

插入序列（IS因子）
特征：


很小的DNA片段
末端具有倒置重复序列
10
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转座作用的机制

限制性内切酶切开靶序列 转座子插入，形成具有单 链粘性末端的转座子


修补缺刻，形成直接重复 序列。
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分为复制型和非复制型两大类
复制型
非复制型
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遗传效应

引起插入突变，可导致基因表达失活。 产生新的基因。 产生的染色体畸变，引起DNA缺失或倒位。 引起的生物进化，可产生新的生物学功能的基 因。
5´
3´
3´ 5´ 片 段 重 组 5´3´ 体
拼 5´ 接 3´ 重 组 体 5´
3´
DNA 连接酶
3´ 5´
3´ 5´
二、细菌的基因转移与重组
（一）接合（conjugation）
质粒
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（二）转化（transformation)
目录
（三）转导(transduction)
目录目录
（二）载体的选择和构建
克隆载体(cloning vector)
扩增DNA
表达载体(expression vector) 让DNA表达成蛋白质
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载体的要求
能自主复制；
具标记，便于筛选；
有多个单一酶切位点
有一定的容量
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质粒 (plasmid)
转导作用 (transduction) 转 座 (transposition)
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一、同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组
(homologous recombination) ，又称基本重 组（general recombination）。
目录
5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´
内切酶
3´ (recBCD)
3´ 5´ 5´ 3´
5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´ 3´ 5 ´ 3´
DNA侵扰 (recA)
5´ 3´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ 3´
分支迁移 (recA)
内切酶 (recBCD)
5´ 3´ 3´ 3´
3´ 5´ 5´ 3´
DNA 连接酶
5´ 3´ 3´ 5´
T4 DNA连接酶 15º C
载体自连
重组体
目的基因自连
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
双酶切克隆
目录
平端连重组体
载体自连
目的基因 自连
（四）重组DNA转入宿主细胞 质粒DNA：制备感受态细菌，转入 噬菌体DNA：包装后吸附感染细菌 病毒载体：包装后感染受体细胞