二苯乙烯苷对载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的防治作用

二苯乙烯苷对载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的防治
作用
张又枝;黄琦;闵清;廖清船;蔡飞
【摘要】Objective To observe the protective effect and mechanism of 2,3,5,4 '-tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside ( THSG) on atherosclerosis in ApoE konck-out mice. Methods A total of 24 ApoE knock-out mice were randomly divided into normal control group (n=8), model control group (HFD, high-fat diet, n=8) and treated group (THSG, 20 mg· kg-1, i. g. , n=8). The atherosclerosic plaque of aorta wall and aorta root were measured by oil red O staining;The expression of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 (LOX-1) in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) through C-reaction protein ( CRP) was studied by Western blotting. Results The atherosclerosis plaque in normal control group was not observed. The lipid accumulation decreased in the aorta and the plaque areas in the aortic sinus in THSG treated-group compared with model control group. Moreover, THSG down-regulated CRP-induced LOX-1 expression in HUVEC. Conclusion The atheroscletosis plaque in ApoE knock-out mice was decreased by THSG. The mechanism might be related to the inhibition of the expression of LOX-1 protein.%目的探讨二苯乙烯苷对载脂蛋白E(ApoE)敲除小鼠动脉粥样硬化的防治作用及其机制.方法 ApoE敲除小鼠24只,随机分为正常对照组、模型对照组(高脂饲料)和治疗组(二苯乙烯苷20 mg·kg-1灌胃给药,每天1次),每组8只.通过主动脉和心脏主动脉窦冰冻切片油红O染色,观察二苯乙烯苷对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块
的作用;Western blotting方法检测二苯乙烯苷对C反应蛋白(CRP)诱导的人脐静脉内皮细胞血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX-1)蛋白表达的影响.结果正常对照组主动脉未见明显的斑块沉积,模型对照组呈现红色着色和点状脂质条纹沉积;与模型对照组比较,治疗组血管脂质沉积减少,心脏主动脉窦粥样斑块面积减小.二苯乙烯苷可降低CRP诱导的LOX-1蛋白表达.结论二苯乙烯苷可能通过抑制LOX-1的蛋白表达,减少ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块形成.
【期刊名称】《医药导报》
【年(卷),期】2017(036)001
【总页数】4页(P13-16)
【关键词】二苯乙烯苷;血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1;载脂蛋白E基因敲除;动脉粥样硬化
【作者】张又枝;黄琦;闵清;廖清船;蔡飞
【作者单位】湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室咸宁 437100;湖北科技学院药学院药理教研室,咸宁 437100;湖北科技学院药学院药理教研室,咸宁 437100;湖北科技学院药学院药理教研室,咸宁 437100;湖北科技学院药学院药理教研室,咸宁 437100;湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室咸宁 437100
【正文语种】中文
【中图分类】R282.71;R965
DOI 10.3870/j.issn.1004-0781.2017.01.003
动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是心脑血管疾病的共同病理生理基础，也是引
发急性冠脉综合征的原因之一。

氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)是 AS 的独立危险因素，血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1, LOX-1)是内皮细胞摄取 ox-LDL 的主要受体之一，在 AS 斑块形成中具有重要作用。

已有研究表明，急性冠脉综合征患者血液中 LOX-1 水平显著增加，且 LOX-1 可作为急性冠脉综合征的早期诊断指标[1]。

二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside，THSG)是白藜芦醇的结构类似物，属于二苯乙烯类。

研究发现，THSG 抑制大鼠 AS 的形成，既与其抗炎、抗氧化和舒张血管等作用相关，也与其改善脂质代谢相关[2-3]。

载脂蛋白 E(apoliprotein E, ApoE)基因敲除小鼠是自发形成AS的理想动物模型，THSG 对该基因敲除小鼠是否具有抗 AS 的作用，笔者尚未见报道。

本研究通过 ApoE 基因敲除小鼠模型，观察 THSG 对AS 粥样斑块的作用及其机制。

1.1 实验动物雄性 ApoE基因敲除小鼠，鼠龄6～8周，体质量18～22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2014-0004；合格证号：11401300032681。

在无特定病原体(SPF) 级动物房自由饮水和摄食，光照12 h·d-1，室温20～25 ℃，相对湿度(60±40)%。

1.2 药品与试剂 THSG(南京泽朗医药科技有限公司，含量>90%)；C-反应蛋白(C-reaction protein, CRP)因子购自Sigma公司(批号：C1617)；兔抗小鼠LOX-1和β-actin 多克隆抗体(批号：17958-1-AP；20536-1-AP)均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 仪器冰冻切片机(Thermo)；电泳仪和转膜仪(北京六一仪器有限公司)；倒置显微镜(Olympus)。

1.4 动物分组、模型制备及给药方法取ApoE 基因敲除小鼠24只，适应性饲养1周后，随机分为正常对照组、模型对照组和治疗组，每组8只。

正常对照组给予
常规饮食；模型对照组和治疗组小鼠给予“西方饮食”(脂肪21%，胆固醇0.05%)喂养，自发形成AS模型[4]，治疗组同时灌胃给予20 mg·kg-1THSG，每天1次，共8周。

1.5 主动脉分离及油红O染色小鼠灌胃THSG 8周后，处死，迅速分离胸主动脉，洗去血液，4%多聚甲醛固定24 h；在解剖显微镜下，行主动脉纵向剖开，剥去动脉壁的外膜，用针灸针将其固定在黑色蜡板上，油红O染色中浸染5 h，放入60%异丙醇中分化，换3或4次分化液，直到AS斑块成红色，而动脉壁成白色，自来水冲洗。

1.6 心脏主动脉窦处冰冻切片及油红O染色小鼠灌胃THSG 8周后，处死，迅速
分离心脏，PBS 中洗去心脏血液，4%多聚甲醛中固定24 h；15%和 30%蔗糖中
依次脱水。

最后放入冰冻切片机上切片，每颗心脏在三尖瓣位置行切片5张，油
红O染色，在显微镜下摄像。

1.7 人脐静脉内皮细胞LOX-1蛋白表达检测按照文献[5]方法培养原代人脐静脉内皮细胞，取其第2～8代细胞进行实验。

待细胞融合之后，分为3组：Ctr 组，CRP 组(20 μg·mL-1)，THSG+CRP 组(25 μnmol·L-1 THSG+CRP)。

RIPA 缓冲
液裂解、提取细胞蛋白，二辛可宁酸法测定蛋白浓度；各组取蛋白20 μg上样，
在恒压100 V条件下，经过蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结束后，在恒
流条件下，转膜将凝胶转移至聚偏氟乙烯膜上。

敷上一抗(LOX-1，1∶500；β-actin，1∶1 000)4 ℃下过夜。

室温条件下TBST摇床洗膜3次，每次3 min，再
用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，经TBST洗膜3次，应用
化学发光法显影，暗室内压片、显影和定影。

用 ImageJ灰度扫描软件进行条带密度分析。

1.8 统计学方法用SPSS16.0版软件对实验数据进行统计学分析。

采用One-way ANOVA分析对均数进行比较。

以P<0.05表示差异有统计学意义。

2.1 THSG对ApoE 敲除小鼠主动脉粥样斑块的作用胸主动脉经固定，油红 O 染
色后，肉眼观察。

见图1，正常对照组血管壁光滑，呈淡粉色，未见明显红色着色。

模型对照组可见血管壁略凹凸不平，见红色着色和点状脂质条纹沉积。

治疗组血管壁光滑，可见很少红色着色点脂质条纹沉积。

2.2 THSG对 ApoE 敲除小鼠心脏主动脉窦粥样斑块的作用见图2，正常对照组主动脉窦冰冻切片油红 O 染色后自发产生动脉粥样硬化斑块，模型对照组斑块面积
增加；与模型对照组比较，治疗组斑块面积减少。

2.3 THSG对内皮细胞LOX-1蛋白表达的影响见图3，给予CRP后LOX-1蛋白
表达增加(t=5.63, P<0.01)，给予THSG后抑制其蛋白表达(t=14.62, P<0.01)。

AS斑块的形成机制复杂，与脂质沉积、炎症反应等多种因素有关。

研究AS的动
物模型有多种，如大鼠和家兔给予高脂饲料喂养或家兔颈动脉球囊损伤等形成斑块，但其形成粥样斑块的时间长，不明显，以及形成机制与人类粥样斑块不同[6-7]。

现有研究多采用基因敲除小鼠，主要包括ApoE敲除和LDLR敲除小鼠等[4]。

敲
除小鼠的ApoE基因，从而影响其血脂的代谢，自发形成AS，与人类AS斑块分
布相似，该模型稳定，成熟，是国际上公认的研究AS的小鼠模型。

THSG是中药何首乌中提取的有活性的单体，具有调节血脂和抗炎等作用，但其对自发性AS小鼠模型的作用笔者尚未见报道。

本研究表明，ApoE基因敲除小鼠在主动脉和主动脉窦处自发形成AS斑块，给予高脂饮食其斑块明显，灌胃THSG后，其斑块面积缩小。

本研究选取AS的独立危险因素LOX-1作为切入点[8]。

LOX-1是ox-LDL的特异性受体。

内皮细胞通过LOX-1受体摄取ox-LDL，结合、吞噬并降解ox-LDL。

LOX-1可损伤内皮细胞、单核细胞粘附聚集、诱导内皮细胞凋亡等机制促进AS
的形成和发展[1]。

ox-LDL通过LOX-1与血管内皮细胞相互作用，引起血管内皮
细胞损伤及内皮功能障碍，而血管内皮功能紊乱是AS的始动因素。

炎症因子CRP是AS等心血管事件的重要标志物，诱导LOX-1的表达，引起血管内皮细胞功能紊乱，促发形成AS[9]。

本研究表明CRP增加人脐静脉内皮细胞LOX-1的蛋白表达，与文献研究结果一致。

给予THSG后，抑制CRP诱导的LOX-1的蛋白表达，减少了AS斑块的形成，为THSG的开发、利用提供进一步的理论依据。

【相关文献】
[1] CHEN X P, ZHANG T T, DU G H. Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,
a new promising target for the therapy of atherosclerosis[J]. Cardiovas Drug Rev, 2007,
25(2):146-161.
[2] 沈燕，王春华，王玉琴，等．二苯乙烯苷对动脉硬化大鼠一氧化氮合酶及其基因的调节作用[J]．中国中药杂志,2008, 33(8)：919-923.
[3] 崔慧辉，田英，龙石银．二苯乙烯苷抗动脉粥样硬化的作用和机制[J]. 现代生物医学进展, 2009, 9(20):3968-3971.
[4] BURNETT M S, GAYDOS C A, MADICO G E, et al. Atheroscletosis in apoE knockout mice infected with multiple pathogens[J]. J Infect Dis, 2001, 183(2): 226-231.
[5] WEYMANN A, SCHMACK B, OKADA T, et al. Reendothelialization of human heart valve neoscaffolds using umbilical cord-derived endothelial cells[J]. Circ J, 2013, 77(2): 207-216.
[6] 连伟光，郑龙，尤红煜，等．HFJ大鼠与Wistar大鼠用于动脉粥样硬化造模的比较研究[J]. 四川动物，2013,32(7): 588-594.
[7] 杨梅，周建光，曹海涛，等．实验动物动脉粥样硬化模型的建立与评价[J]. 医疗装备, 2010,
23(6): 35-37.
[8] 李倩，芮耀诚．LOX-1——心血管疾病防治的新靶标[J]. 药学实践杂志，2014， 32(5):321-323.
[9] HEIN T W, QAMIRANI E, REN Y, et al.Selective activation of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 mediates C-reactive protein-evoked endothelial vasodilator dysfunction in coronary arterioles[J]. Circ Res， 2014,114(1): 92-100.。