荧光法测定水果的总抗氧化活性
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荧光法测定水果的总抗氧化活性
1 项目设计的意义 癌症与冠心病是世界公认的人类健康杀手。在西方国家，癌症是导致65 岁 以下人员死亡的最主要原因，每年美国政府花在治疗心血管疾病上的资金高达 500～1000 亿美元。 大量的证据表明细胞代谢或脂类过氧化反应产生的自由基是 癌症和冠心病形成的病因。抗氧化物质可以阻断自由基侵袭，降低了癌症、冠心 病及其他老年疾病的发病风险。食物中抗氧化物质长期以来倍受国内外学者关 注，从食物中获取抗氧化物质成为一种健康有效的生活方式，科研人员也相继从 食品中发现大量抗氧化物质。 食物中抗氧化物质能够保护食物免受氧化损伤而变 质，在人体消化道内具有抗氧化作用，防止消化道发生氧化损伤，吸收后可在机 体其他组织器官内发挥作用， 来源于食物的某些具有抗氧化作用的提取物可以作 为治疗药品。 如何正确真实地评价食品的抗氧化性成为首要解决的问题，食品抗 氧化能力的评价方法随着科学技术的发展和设备的更新而不断地发展和改变。 一 些过程繁琐、 准确性不高的评价方法逐渐被淘汰，下面介绍一种间接荧光法测定 食品的抗氧化活性。用 Mn 2 - H 2O 2 体系产生羟自由基,建立了灵敏度高、稳定性 好的一种荧光法测定羟自由基清除率的体系。 2 项目设计的原理 荧光法是以荧光物质作为氧化底物， 其本身在一定的激发波长下可以发出荧 光，在自由基攻击下荧光特性消失或增强，当有抗氧化物质存在时，抗氧化物质 可以清除溶液中的自由基，使其荧光消失程度减弱或者使其荧光增强程度降低， 总之都是引起荧光强度变化。通过测定自由基形成前后荧光底物的荧光强度变 化，测定自由基的产生量，通过计算自由基清除率（%）来评价受试样的抗氧化 能力。
Mn 2 可与 H 2 O 2 作用类似Fenton反应产生羟自由基,
产率比 FeSO 4 还要高,
其反应原理可类推如下:
Mn 2 H 2 O 2 Mn(III ) OH OH Mn( III) H 2 O 2 Mn( IV) OH OH 然后, 利用羟自由基迅速氧化荧光素钠, 使荧光素钠的荧光强度显著降低, 降 低程度随羟自由基的增加而加大, 从而间接测定羟自由基的产生量。 而水果提取 物可以部分清除溶液中的羟自由基, 从而使其荧光猝灭程度减弱, 据此可以测 定水果抗氧化性。 3 主要仪器和试剂
样品 荧光度 消除率（%） 1 2 3 4 5
6 结果与讨论 很多研究都报道了不同水果的抗氧化活性，但结果有一定的差异。首先可能 是受抗氧化物质含量、抗氧化物质组成上的差异性以及水果产地、品种等因素的
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影响。其次，更为重要的可能是测定方法的差异，测定水果抗氧化活性的方法较 多，如FRAP 法、DPPH·法、ORAC 法、ABTS 法等。由于不同的方法清除的自由 基种类不同， 某一种方法体现出的清除自由基能力并不能反映对其他自由基的清 除能力或总抗氧化能力， 因此采用多种方法评价抗氧化能力得到的结果更具合理 性、科学性，目前国外应用较多的为ORAC 法。ORAC 法反映的是样品的总抗氧化 能力， 该法使用较昂贵的试剂和荧光分光光度计，且荧光素钠的荧光强度对反应 体系的pH 相对敏感，当pH低于7时，其荧光强度显著降低，另外，该方法对温度 非常敏感；但该方法灵敏度高，稳定性好。 参考文献： [1]方 敏，王耀峰，宫智勇.15 种水果和 33 种蔬菜的抗氧化活性研究.食品科 学.2008 年， 第 29 卷，第 10 期 [2]芦双，董静洲，孙紫薇.常见多汁类水果、蔬菜的总抗氧化活性的研究.湖北 民族学院学报( 自然科学版),2011.12.第 29 卷.第 4 期 [3]黄莉娟，胡蝶，张萍，聂迎春.柑橘的抗氧化活性研究.现代食品科技.2012. 第 28 卷.第 4 期 [4]郑 炜.果蔬抗氧化作用机理及评价方法研究进展.浙江林业科技.2004.3 .第 24 卷第 2 期 [5] 张名位,郭宝江.果蔬抗氧化作用研究进展.华南师范大学学报( 自然科学 版).2011 年第 4 期 [6]王琦，余亚白，赖呈纯，陈源，高慧颖，谢鸿根.几种台湾水果的抗氧化能力 研究.福建农业学报.2010.第 25 卷第 6 期 [7]许红星，曹晖，刘方方.两种方法评价常见水果的抗氧化活性.扬州大学烹饪 学报.2012 第 4 期 [8]秦延河.罗丹明 B- Mn2+ - H2O2 体系光度法测定水果的抗氧化性.江西师范 大学学报( 自然科学版)2005 年 11 月第 29 卷第 6 期 [9]邹磊，甄少波，宋杨.食品抗氧化能力检测方法的研究进展.食品工业科 技.2011.第 6 期第 32 卷 [10]臧运波, 张爱梅.荧光素钠 Mn 2 H 2O2 体系荧光法测定常见水果的抗氧化活 性.分析科学学报.2005.2.第 21 卷第 1 期
所用试剂均为分析纯, 水为二次蒸馏水。 4 实验内容和步骤 4.1 羟自由基的测定 在 10 ml 具塞刻度试管中, 加入 8 10- 4 g/ L 的荧光素钠 0.5 ml, pH 9.4 的 缓冲溶液 0.3 ml, 2.0 m mol/ L 的 Mn 2 溶液 0.3 ml, 0. 1%的 H 2O 2 溶液 0. 5 ml, 加蒸馏水至刻度, 混匀。7 min 后, 以 491/ 512 nm 测定荧光强度 F, 计算其与 空白参比( 荧光素钠与缓冲液) 荧光强度 Fo 之差△F , 通过测定 OH 形成前后 荧光素钠的荧光强度变化, 测定 OH 的产生量。 4. 2 羟自由基清除率的测定 在上述体系中加入一定量的羟自由基清除剂 , 同样操作测定荧光强度 Fs ; 荧光素钠和缓冲溶液作为空白体系, 其荧光强度为 Fo ; 未加清除剂的体系, 其 荧光强度为 F; 则清除率= ( Fs —F) / (Fo —F )×100% 。 4.3 水果水提取物清 OH 的作用 新鲜水果洗净, 晾干, 准确称取 40 g, 加入 200 ml 蒸馏水, 匀浆 3min, 过滤, 离心 5 min, 上层清液稀释若干倍后取 1 ml 按上述方法进行测定其荧光度 F 1 ， 多次测定。 5 数据处理与结果计算 5.1对各反应体系在500— 540 nm 范围内进行扫描, 得发射光谱图 5.2计算样品对羟自由基的清除率 清除率= ( F 1 —F) / (Fo —F )×100% 5.3记录数据并计算本方法的相对标准偏差
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LS-55 型荧光分光光度计( 美国, PE 公司) 。
MnSO 4 溶液: 2.0 m mol/L; H 2O 2 溶液: 0.1%; 荧光素钠溶液: 8 10- 4 g/ L;
pH 9.4 的 0.4 mol/ L
NH 3 - NH 4 Cl L。
则清除率43水果水提取物清oh的作用新鲜水果洗净晾干准确称取40加入200ml蒸馏水匀浆3min过滤离心5min上层清液稀释若干倍后取1ml按上述方法进行测定其荧光度f数据处理与结果计算51对各反应体系在500540nm范围内进行扫描得发射光谱图52计算样品对羟自由基的清除率清除率10053记录数据并计算本方法的相对标准偏差样品荧光度消除率结果与讨论很多研究都报道了不同水果的抗氧化活性但结果有一定的差异
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1 项目设计的意义 癌症与冠心病是世界公认的人类健康杀手。在西方国家，癌症是导致65 岁 以下人员死亡的最主要原因，每年美国政府花在治疗心血管疾病上的资金高达 500～1000 亿美元。 大量的证据表明细胞代谢或脂类过氧化反应产生的自由基是 癌症和冠心病形成的病因。抗氧化物质可以阻断自由基侵袭，降低了癌症、冠心 病及其他老年疾病的发病风险。食物中抗氧化物质长期以来倍受国内外学者关 注，从食物中获取抗氧化物质成为一种健康有效的生活方式，科研人员也相继从 食品中发现大量抗氧化物质。 食物中抗氧化物质能够保护食物免受氧化损伤而变 质，在人体消化道内具有抗氧化作用，防止消化道发生氧化损伤，吸收后可在机 体其他组织器官内发挥作用， 来源于食物的某些具有抗氧化作用的提取物可以作 为治疗药品。 如何正确真实地评价食品的抗氧化性成为首要解决的问题，食品抗 氧化能力的评价方法随着科学技术的发展和设备的更新而不断地发展和改变。 一 些过程繁琐、 准确性不高的评价方法逐渐被淘汰，下面介绍一种间接荧光法测定 食品的抗氧化活性。用 Mn 2 - H 2O 2 体系产生羟自由基,建立了灵敏度高、稳定性 好的一种荧光法测定羟自由基清除率的体系。 2 项目设计的原理 荧光法是以荧光物质作为氧化底物， 其本身在一定的激发波长下可以发出荧 光，在自由基攻击下荧光特性消失或增强，当有抗氧化物质存在时，抗氧化物质 可以清除溶液中的自由基，使其荧光消失程度减弱或者使其荧光增强程度降低， 总之都是引起荧光强度变化。通过测定自由基形成前后荧光底物的荧光强度变 化，测定自由基的产生量，通过计算自由基清除率（%）来评价受试样的抗氧化 能力。
Mn 2 可与 H 2 O 2 作用类似Fenton反应产生羟自由基,
产率比 FeSO 4 还要高,
其反应原理可类推如下:
Mn 2 H 2 O 2 Mn(III ) OH OH Mn( III) H 2 O 2 Mn( IV) OH OH 然后, 利用羟自由基迅速氧化荧光素钠, 使荧光素钠的荧光强度显著降低, 降 低程度随羟自由基的增加而加大, 从而间接测定羟自由基的产生量。 而水果提取 物可以部分清除溶液中的羟自由基, 从而使其荧光猝灭程度减弱, 据此可以测 定水果抗氧化性。 3 主要仪器和试剂
样品 荧光度 消除率（%） 1 2 3 4 5
6 结果与讨论 很多研究都报道了不同水果的抗氧化活性，但结果有一定的差异。首先可能 是受抗氧化物质含量、抗氧化物质组成上的差异性以及水果产地、品种等因素的
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影响。其次，更为重要的可能是测定方法的差异，测定水果抗氧化活性的方法较 多，如FRAP 法、DPPH·法、ORAC 法、ABTS 法等。由于不同的方法清除的自由 基种类不同， 某一种方法体现出的清除自由基能力并不能反映对其他自由基的清 除能力或总抗氧化能力， 因此采用多种方法评价抗氧化能力得到的结果更具合理 性、科学性，目前国外应用较多的为ORAC 法。ORAC 法反映的是样品的总抗氧化 能力， 该法使用较昂贵的试剂和荧光分光光度计，且荧光素钠的荧光强度对反应 体系的pH 相对敏感，当pH低于7时，其荧光强度显著降低，另外，该方法对温度 非常敏感；但该方法灵敏度高，稳定性好。 参考文献： [1]方 敏，王耀峰，宫智勇.15 种水果和 33 种蔬菜的抗氧化活性研究.食品科 学.2008 年， 第 29 卷，第 10 期 [2]芦双，董静洲，孙紫薇.常见多汁类水果、蔬菜的总抗氧化活性的研究.湖北 民族学院学报( 自然科学版),2011.12.第 29 卷.第 4 期 [3]黄莉娟，胡蝶，张萍，聂迎春.柑橘的抗氧化活性研究.现代食品科技.2012. 第 28 卷.第 4 期 [4]郑 炜.果蔬抗氧化作用机理及评价方法研究进展.浙江林业科技.2004.3 .第 24 卷第 2 期 [5] 张名位,郭宝江.果蔬抗氧化作用研究进展.华南师范大学学报( 自然科学 版).2011 年第 4 期 [6]王琦，余亚白，赖呈纯，陈源，高慧颖，谢鸿根.几种台湾水果的抗氧化能力 研究.福建农业学报.2010.第 25 卷第 6 期 [7]许红星，曹晖，刘方方.两种方法评价常见水果的抗氧化活性.扬州大学烹饪 学报.2012 第 4 期 [8]秦延河.罗丹明 B- Mn2+ - H2O2 体系光度法测定水果的抗氧化性.江西师范 大学学报( 自然科学版)2005 年 11 月第 29 卷第 6 期 [9]邹磊，甄少波，宋杨.食品抗氧化能力检测方法的研究进展.食品工业科 技.2011.第 6 期第 32 卷 [10]臧运波, 张爱梅.荧光素钠 Mn 2 H 2O2 体系荧光法测定常见水果的抗氧化活 性.分析科学学报.2005.2.第 21 卷第 1 期
所用试剂均为分析纯, 水为二次蒸馏水。 4 实验内容和步骤 4.1 羟自由基的测定 在 10 ml 具塞刻度试管中, 加入 8 10- 4 g/ L 的荧光素钠 0.5 ml, pH 9.4 的 缓冲溶液 0.3 ml, 2.0 m mol/ L 的 Mn 2 溶液 0.3 ml, 0. 1%的 H 2O 2 溶液 0. 5 ml, 加蒸馏水至刻度, 混匀。7 min 后, 以 491/ 512 nm 测定荧光强度 F, 计算其与 空白参比( 荧光素钠与缓冲液) 荧光强度 Fo 之差△F , 通过测定 OH 形成前后 荧光素钠的荧光强度变化, 测定 OH 的产生量。 4. 2 羟自由基清除率的测定 在上述体系中加入一定量的羟自由基清除剂 , 同样操作测定荧光强度 Fs ; 荧光素钠和缓冲溶液作为空白体系, 其荧光强度为 Fo ; 未加清除剂的体系, 其 荧光强度为 F; 则清除率= ( Fs —F) / (Fo —F )×100% 。 4.3 水果水提取物清 OH 的作用 新鲜水果洗净, 晾干, 准确称取 40 g, 加入 200 ml 蒸馏水, 匀浆 3min, 过滤, 离心 5 min, 上层清液稀释若干倍后取 1 ml 按上述方法进行测定其荧光度 F 1 ， 多次测定。 5 数据处理与结果计算 5.1对各反应体系在500— 540 nm 范围内进行扫描, 得发射光谱图 5.2计算样品对羟自由基的清除率 清除率= ( F 1 —F) / (Fo —F )×100% 5.3记录数据并计算本方法的相对标准偏差
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LS-55 型荧光分光光度计( 美国, PE 公司) 。
MnSO 4 溶液: 2.0 m mol/L; H 2O 2 溶液: 0.1%; 荧光素钠溶液: 8 10- 4 g/ L;
pH 9.4 的 0.4 mol/ L
NH 3 - NH 4 Cl L。
则清除率43水果水提取物清oh的作用新鲜水果洗净晾干准确称取40加入200ml蒸馏水匀浆3min过滤离心5min上层清液稀释若干倍后取1ml按上述方法进行测定其荧光度f数据处理与结果计算51对各反应体系在500540nm范围内进行扫描得发射光谱图52计算样品对羟自由基的清除率清除率10053记录数据并计算本方法的相对标准偏差样品荧光度消除率结果与讨论很多研究都报道了不同水果的抗氧化活性但结果有一定的差异
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