生化实验思考题

⽣化实验思考题
1. 氨基酸的纸层析分离
1. 什么是纸层析技术
是利⽤混合物中各组分物理化学性质差异，使其以不同速度移动的⼀种物理分
离⽅法。

2. 什么是分配系数
分配系数是指溶质在固定相中的浓度和溶质在流动相中的浓度的⽐值。

3. 层析技术的种类
1 吸附层析
2 分配层析
3 离⼦交换层析
4 凝胶过滤层析
5 亲和层析
6 ⽓象层析
7 固相层析
8 柱层析
9 纸层析
10 薄层层析
11 ⾼效液相层析
4. 影响Rf值的因素有哪些
1 纸层析时纸层析时要在密闭仪器中加⼊平衡试剂使纸层析上吸附的溶剂达到
饱和.
2 滤纸要保持洁净,点样时要适量斑点不能过⼤.
3 样品物分⼦结构和极性
4 滤纸的厚薄和纤维松紧度不⼀样，结合的⽔量也不⼀样。

2. 酵母RNA的提取和分离
1. 试验中为什么选择⼲酵母做实验材料？
酵母中RNA含量较⾼（2.67%~10.0%），DNA含量少
2. 提取RNA的⽅法有⼏种？
稀碱法和浓盐法
3. 加⼊酸性⼄醇的⽬的？
在碱提取液中加⼊酸性⼄醇溶液可使解聚的核糖核酸沉淀，由此得到RNA的粗制品。

4. 如何鉴定RNA的组分？现象如何？
RNA中含有核糖，碱基，磷酸各组分。

核糖与浓盐酸和苔⿊酚共热产⽣绿⾊；嘌
呤碱与银铵络离⼦共热⽩⾊絮状嘌呤银化物沉淀；磷酸与钼酸铵试剂作⽤产⽣黄⾊的磷钼酸铵，加硫酸煮沸可使其⽔解，从⽔解液中可以测出上述组分的存在。

3. 球蛋⽩提取及含量测定
1. 蛋⽩质沉淀⽅法有哪些？
分可逆沉淀法和不可逆沉淀法两种。

其中可逆沉淀法有等电点沉淀，中性盐沉淀法，有机溶剂沉淀法；不可逆沉淀法有加热沉淀，重⾦属盐沉淀，⽣物碱沉淀。

2. 蛋⽩质含量测定的⽅法
紫外分光光度计，可见光光度计，双缩脲法，福林酚法
3. 分光光度计的使⽤及注意事项
1 接电源，打开样品室暗箱盖，预热20min
2 调节所需波长
3 开盖放⿊⾊⽐⾊⽫，关盖，调T%为0%
4 放空⽩对照，放样品液到⽐⾊⽫2/3到3/4处，⽤擦镜纸擦⼲表⾯，在对照组
处调T为100%
5 调节T%到ABS，分别测各样品分光光度值
4. 盐析原理
将⼤量盐加到蛋⽩质溶液中,⾼浓度的盐离⼦（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的⽔化⼒,可夺取蛋⽩质分⼦的⽔化层,使之“失⽔”,于是蛋⽩质胶粒凝结并沉淀析出.盐析时若溶液pH在蛋⽩质等电点则效果更好.由于各种蛋⽩质分⼦颗粒⼤⼩、亲⽔程度不同,故盐析所需的盐浓度也不⼀样,因此调节混合蛋⽩质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋⽩质分段沉淀.
4. 影响酶促反应速度的因素
1. 影响酶促反应速度的因素有哪些？
温度，pH，抑制剂，激活剂
2. 唾液淀粉酶的抑制剂，激活剂分别是？
激活剂：Cl-；抑制剂：Cu2+
3. NaOH对v反应实验，做碘反应实验前为何加盐酸
因为碘遇NaOH变NaI和NaIO3，⽽不能与淀粉发⽣反应，所以加⼊盐酸中和氢氧化钠。

4. 温度如何影响酶活性？
⼀般来讲,每种酶的酶活性有最适温度,在此温度下,其活性最⾼,偏离此最适温度时,温度越低,或者温度越⾼,其活性越⼩.⽽且,温度过⾼会导致酶失活以及变性. 5. 植物组织中丙酮酸含量的测定
1. 本实验中氢氧化钠的作⽤？
丙酮酸与2,4-⼆硝基苯肼发⽣反应，⽣成的丙酮酸-2,4-⼆硝基苯腙，在碱性条件
下显红⾊，因此氢氧化钠作⽤是提供碱性环境。

2. 本实验中所加试剂为何不能颠倒？
因为本实验中所⽤的丙酮酸与三氯⼄酸均为酸性，⽽2,4-⼆硝基苯肼与丙酮酸的反应需要在碱性条件下显⾊；三氯⼄酸的作⽤是除去蛋⽩质，使之沉淀，如果后加，试验结果可能会被其他蛋⽩质⼲扰。

3. 制作丙酮酸标准曲线时为什么以8%三氯⼄酸为空⽩对照？
因为本实验所⽤提取液是8%三氯⼄酸溶液，所⽤丙酮酸均溶解于该溶液中。

4. 测定丙酮酸含量的基本原理
植物样品组织经三氯⼄酸除去蛋⽩质后，所含丙酮酸与2,4-⼆硝基苯肼发⽣反应，⽣成的丙酮酸-2,4-⼆硝基苯腙，在碱性条件下显红⾊。

测定样品吸光度，与丙酮酸标准曲线相⽐较即可得丙酮酸含量。

06.DNA的提取及含量测定
1.DNA提取中各试剂中英⽂名称及作⽤
●SDS:⼗⼆烷基硫酸钠，使蛋⽩质变性及破坏脱氧核酸降解酶
●CHCl3:氯仿，使蛋⽩质沉淀被除去
●⼄醇:使DNA呈纤维状沉淀出来
●Na2EDTA:⼄⼆胺四⼄酸⼆钠，抑制DNA酶活性，与Mg2+结合，保护
DNA
●NaCl:使蛋⽩质溶解
●CH3CHO:⼄醛，提⾼反应灵敏度
2.加⼊氯仿后出现什么现象？
溶液分三层，上层为DNA溶液，中层为蛋⽩质沉淀，下成为有机层
3.DNP与RNP在盐溶液中溶解度有什么不同？
DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响⽽不同。

DNP在低浓度盐溶
液中，⼏乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在⽔中溶解度
的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，⾄1mol/L氯化钠中的溶解度很⼤，
⽐纯⽔⾼2倍。

RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较⼩，在0.14mol/L氯化钠中溶解度
较⼤。

因此，在提取时，常⽤此法分离这两种核蛋⽩。

4.定糖法测定DNA含量的原理
DNA分⼦中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，产⽣2-脱氧核糖并形成
ω-羟基-γ-酮基戊酸，后者与⼆苯胺试剂反应产⽣蓝⾊化合物，其反应如下图。

蓝⾊化合物在595nm处有最⼤吸收，且DNA在40µg ~400µg范围内时，吸光
度与DNA浓度成正⽐。

在反应液中加⼊少量⼄醛，可以提⾼反应灵敏度。

7.植物过氧化物同⼯酶聚丙烯酰氨凝胶电泳
1. 什么是电泳，同⼯酶，等电点？
●在溶液中，蛋⽩质分⼦会由于氨基酸的解离⽽带电荷，电场中蛋⽩质带电粒
⼦会向与⾃⾝电荷相反的电极泳动，这就是电泳。

●指⽣物体内催化相同反应但分⼦结构不同的⼀组酶
●氨基酸分⼦静电荷为零时的PH
2. Acr,Bis,AP,TEMED各⾃中⽂名称及作⽤？
Acr：丙烯酰胺，作为单体；Bis:甲叉双丙烯酰胺，交联剂;AP：0.15%过硫酸铵，
化学聚合催化剂;TEMED：四甲基⼄⼆胺，加速剂
3. 过氧化物酶的底物是什么？
H2O2
4. 溴酚蓝的作⽤？
指⽰电泳前沿：溴酚蓝分⼦带负电，⽐蛋⽩质⼩迁移速度快，总是位于蛋⽩质之
前。

5. 本实验使⽤的缓冲溶液是什么？写出各⾃的名称，PH
●提取液缓冲液：PH=8.0
●电极缓冲溶液：PH=8.3
●上样缓冲溶液：PH=8.9
8.蔗糖酶⽶⽒常数的测定
1. 为什么说Km是酶的特征常数？什么是Km？单位是什么？
⼀个酶对⼀个特定的底物有⼀个特定的Km与之对应；Km是酶促反应最⼤速度1/2
时的底物浓度；单位：mol/L、m mol/L
2. 双倒数作图法求Km值，横纵坐标分别是什么？
横：1/【s】；纵：1/v。

（【s】是底物浓度）
3. NaOH作⽤？
使酶失活，反应停⽌
4. 涉及化学反应：
蔗糖⽔解为葡萄糖；3,5﹣⼆硝基⽔杨酸与葡萄糖加热反应⽣成棕红⾊的3﹣氨基﹣5﹣硝基⽔杨酸9.胰蛋⽩酶活性的测定
1. 酶活单位如何定义？
⼀个酶活⼒单位是指在最适条件下，在⼀分钟内能转化1µmol底物所需要的酶量
2. 紫外分光光度计使⽤⽅法
设置波长：【Goto WL】键设置波长
【T%/ABS】：按【T%/ABS】可在透光率(T%)和吸光度(ABS)之间切换。

保存参数：可将当前参数保存在内存或数据包内。

测量屏幕：确定参数后按【样品测定】或【START/STOP】键的同时进⾏第⼀次测量，每按⼀次得到⼀个数据。

⾃动调零：当需要空⽩校正时，在测量前设置好空⽩样品，然后按【AUTO ZERO】键，此时的光度值设定为
0ABS（100%）
3. BAEE,BA中⽂名
BAEE：N﹣苯甲酰﹣L﹣精氨酸⼄酯
BA：N﹣苯甲酰﹣L﹣精氨酸
10.植物体内游离脯氨酸含量的测定
1. 植物体内游离脯氨酸有何意义？
●植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到⼲旱、盐碱、低温等逆境时，
游离脯氨酸便会⼤量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。

因此，脯氨酸可
作为植物抗逆性的⼀项⽣化指标。

●脯氨酸是⽔溶性最⼤的氨基酸，具有很强的⽔和能⼒，其⽔溶液具有很⾼的⽔势。

其疏⽔端可与蛋⽩质结合，亲⽔端可与⽔分⼦结合，蛋⽩质可借脯氨酸束缚更多
的⽔，从⽽防⽌渗透胁迫条件下蛋⽩质脱⽔变性。

因此脯氨酸在植物的渗透调节
中起重要作⽤。

2. 当改变萃取剂时⽐⾊应做哪些改变？如何选择最佳的萃取剂？
●当萃取剂发⽣改变时，测定光密度的波长应当改变，具体如何改变，根据实验⽽
定。

●萃取剂选⽤原则：a.萃取机和原溶剂互不相容b.萃取剂和溶质互不发⽣反应c.溶
质在萃取剂中溶解度远⼤于在原溶剂中溶解度。

11.植物基因组DNA的提取与纯度测定
1.CTAB的作⽤？
使核糖体解体，蛋⽩质和多糖沉淀，DNA溶解
2.CTAB溶液中组分有哪些？
●CTAB:⼗六烷基三甲基溴化铵
●Tris-HCl(pH=8.0)：提供⼀个缓冲环境，防⽌核酸被破坏
●EDTA螯合Mg2+和Mn2+：抑制DNA酶活性
●NaCl：提供⾼盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相当中
●β-硫基⼄醇：抗氧化剂，有效防⽌酚被氧化成醌，避免褐变,使酚容易去
除基因组DNA。

3.DNA提取⽅法有哪些？
CTAB法，玻璃珠法，超声波法，研磨法，冻融法，异硫氰酸胍法，碱法，酶法
4.DNA纯度鉴定⽅法
OD260/OD280（紫外分光光度法）、电泳
5.OD260/OD280值⼤于1.8及⼩于1.8的原因
等于1.8时表⽰DNA纯度极⾼，⼤于时表⽰提取物混有RNA，⼩于时表⽰混
有蛋⽩质。

12.基因组DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳
1.什么是限制性内切酶？分为哪⼏种？
是可以识别特定核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷
酸⼆酯键进⾏切割的⼀类酶。

●能识别特定的核苷酸顺序，并在识别点附近进⾏切割，但切割的核苷酸
顺序⽆专⼀性，是随机的。

●能识别专⼀的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割
●能识别的顺序是回⽂顺序，可切成粘性末端也可形成平末端。

2.酶切的原理，EcoRI的酶切位点
G 〡AATT C
C TTAA〡 G
限制性内切酶识别特定核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间
的磷酸⼆酯键进⾏切割
3.琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理
DNA在⾼于等电点PH的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖-磷
酸⾻架在结构上的重复性质相同数量的双链DNA⼏乎带等量的静电荷。

因此
能以同样的速度向正极⽅向移动。

在⼀定电场强度下，DNA迁移速度取决于
分⼦本⾝的⼤⼩与构型，相对分⼦质量不同的DNA泳动速率不同。

4.电泳点样时，加样孔在哪个电极附近，为什么？
负极。

DNA在⾼于等电点PH的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

13.植物总RNA的提取与检测1.常⽤RNA提取⽅法
苯酚法，阴离⼦去污剂法，Licl-尿素法，改良Gomez法，异硫氰酸
胍法，CTAB法，热硼酸法，Trizol试剂快速提取法
2.Trizol试剂提取RNA理论上有⼏条带？分别代表什么？
四条．5SrRNA，5.8SrRNA,18SrRNA,28SrRNA
3.Trizol试剂提取RNA原理
TRIZOL是⼀种新型总RNA抽提试剂，其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能
迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。

在破碎和溶解细胞时能保持RNA
的完整性，适⽤于从多种组织和细胞中快速分离总RNA。

4.植物RNA提取注意事项
1、取植物材料新鲜、幼嫩的部分
2、移液枪头，离⼼管等耗材和试剂需要经过严格的去RNA酶处理
或⽤DEPC ⽔配制。

3、叶⽚⽤⾜够液氮快速研磨。

4、100mg叶⽚对应1mlTRNzol
5、提取RNA后⽴即跑电泳，防⽌RNA被污染
6、跑电泳的槽⼦需要与RNA专⽤槽，或经过特殊处理。

14.SDS-PAGE电泳测定蛋⽩质分⼦量
1.什么是重组蛋⽩：应⽤重组DNA或重组RNA技术⽽获得的蛋⽩质
2.蛋⽩质分⼦量测定⽅法有⼏种？凝胶过滤层析法，SDS-PAGE电泳，⾊谱法，质谱法，沉降法
3.SDS-PAGE电泳的染⾊剂：考马斯亮蓝G-250
4.什么是不连续电泳：不连续电泳是指使⽤不同孔径和不同缓冲系统的电泳。

由于浓缩胶的堆积作⽤，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离胶的界
⾯上先浓缩成⼀窄带，然后在⼀定浓度（或⼀定浓度梯度）的凝胶上进⾏分离。

由于不同孔径凝胶的分⼦筛作⽤，使不连续电泳的分辨率⼤⼤⾼于连续
电泳。