RNA提取操作要领

RNA提取
实验材料
实验耗材：1.5ml灭菌EP管、去RNA酶枪头、、高速低温离心机
试剂：Trizol、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、DEPC水、无水乙醇
实验步骤：
1.对于培养细胞样品：
贴壁细胞：
1)去除培养液，加PBS清洗，按照6孔板每孔加入500μl Trizol细胞裂解
液，移液枪反复吹打至细胞完全脱落后，将细胞裂解液转移至1.5ml 去
RNA EP管中（可置-80℃保存）；
2)每管加入100μl氯仿（三氯甲烷），轻柔的上下颠倒混匀，冰上静置10
分钟，置12000转4℃离心15分钟；小心取出EP管，可清楚看到管内
3分层，从上到下依次为：上层无色透明液体（RNA层）、中层白色沉
淀（脂质层）、下层粉红色油状液体（苯酚-氯仿层）；
3)尽可能多的取出上层无色透明液体（200~300μl）至一新的1.5ml EP管中，
若取出沉淀，需重新离心再取；
4)每管加入等体积异丙醇，振荡、混匀，4℃静置10分钟。

12000转4℃离
心10分钟，取出EP管可见下层白色沉淀，弃上清液；
5)加入500μl 75%无水乙醇（无水乙醇与DEPC水，现配现用），上下颠倒、
摇晃EP管至白色沉淀漂浮，7500转4℃离心5分钟，弃上清，75%无水
乙醇重复清洗一次。

弃上清，瞬时离心数秒，移液枪小心去除多余上清
液，打开EP管盖置超净台风干；
6)至管内白色沉淀消失完全，加20-50μl DEPC水，轻轻振荡溶解RNA。

置-80℃保存一段时间后，用NanoDrop2000测样品RNA浓度，加适量
DEPC水稀释RNA至200或500ng/μl。

2.悬浮细胞：
2000rpm离心3min收集细胞，去上清，加入PBS洗1次，离心去除PBS(尽
量去除干净)，加入相应量的Trizol试剂吹打混匀。

其他步骤同贴壁细胞RNA 提取操作。

3.组织样本：
取50~100mg的组织加入1 ml Trizol试剂，用匀浆器打匀（Trizol 先放于冰上）。

其余步骤同贴壁细胞RNA提取操作。

注意事项：
1.RNA提取尽可能在冰上操作，所用器材及试剂为去RNA处理；
2.Trizol、氯仿、异丙醇、DEPC等试剂对于人体危害较大，使用过程中应注意
个人安全防护；
3.提前将离心机设置成4℃；
4.75%乙醇用无水乙醇与DEPC水配置，且现配现用；
5.在使用75%乙醇清洗完成后尽可能完全的去除乙醇液体残留，这样可以加快
样本中乙醇的完全挥发；
6.RNA在纯化过程中容易受到DNA、蛋白质及有机溶剂的影响，这些残存物
将会影响以后的操作。

光谱分析(Nanodrop)利用物质对不同波长光的吸收度的不同，可以鉴别出溶液纯度及浓度。

RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围一般为1.8-2.0。

7.Nanodrop使用前使用后必须用ddH2O清洗干净，且为保证测量准确使用前
必须空白调零至±0.1范围内。