不同16SrDNA引物对肠道菌群分析差异的比较

论著 不同16S rDNA引物对肠道菌群分析差异的比较
李娟 孙强正 叶长芸 徐建国
摘要 目的 分析不同16s rDNA 通用引物 扩增靶序列在研究肠道微生物菌群分析时的差异,为选择合适
的通用引物扩增肠道微生物菌群提供基础数据。

方法 从一健康成人的粪便中提取总DNA,以两对 通用引物
27F/519R和27F/533R扩增16S rDNA序列,扩增产物分别克隆到PGE M-T载体,建立克隆文库;两个克隆文库分
别挑取65个克隆进行测序,通过序列同源性比对和构建系统发育树,比较两对引物在分析肠道菌群多样性上的差异。

结果 成功构建了L519和L533克隆文库,阳性克隆率分别达到95 3%和92 3%。

533文库和519文库中非
培养或不可培养的克隆比例分别占69 1%和76 6%(P<0 05)。

两文库优势菌群相同,均为梭状芽孢杆菌、拟杆菌、芽孢杆菌和变形杆菌,但各菌群的比例及低丰度菌群的分布稍有差异;在种群多样性上,533文库和519文库中
分别得到22个和17个可操作分类单元,533文库比519文库有更丰富的种群多样性(P<0 05)。

结论 在分析肠
道菌群多样性时,引物27F/533R较27F/519R有更好的兼并性,更适宜于进行肠道菌群结构和多样性的分析。

关键词 16S r DNA;引物;粪便;菌群多样性
中图分类号 R511.7 文献标识码 A 文章编号 1006-2483(2010)03-0005-05
Co mparison of two sets of un i versal p ri m er s of16S r DNA by anal ysis of m icrob ial co mmun ities of stool
sa mp les L I Juan,SUN Q iang-zheng,YE Chang-yun,X U J ian-guo. State K e y Laboratory for Infectious D isease Preventi on and Control,N ational Instit u te for Co mmun icableD isease Control and P revention,China CDC,Beijing 102206, China
Corres p onding author:X U J i an-guo,Email:xujianguo@
Ab stract O bjective T o co m pa re the t wo sets o f un i ve rsal pr i m ers of16S rDNA by investi ga ting t he d iffe rence o f
m i crobial co mm un iti es o f stoo l sa m ples based on t he a m plificati on products.M ethod s The to tal of DNA fro m the stoo l o f a healthy adult w as ex tracted and used as temp l a te to a m plify the conserved reg ion of16S r DNA w ith t w o se ts of pri m ers (27F/519R and27F/533R).A fter pur ificati on,the PCR products w ere c l oned i nto PGE M-T vecto rs and sequenced.T he obta i ned sequences w ere b l asted i n G enbank to ana l y ze the co mmun ity structure of bacter i a.Resu lts T he L519c l one
li brary based on pr i m ers27F/519R and the L533c l one li brary based on pr i m ers27F/533R w ere successfull y constructed.
T he cove rage of positi ve clones attached to95 3%and92 3%respectively.Am ong65c l ones of each li brary,62and60 positi ve clones w ere obta i ned respecti v ely i n L519li brary and i n L533li brary.T he sequence analysis i nd ica ted that t he t wo
li braries had si m ilar propo rti on o f predom i nant species i nc l ud i ng C l ostr i d i a,Bactero i detes and Bac ill.i A s for m i nor spec ies, there we re d ifferences bet ween the t wo li braries.A c l one belong i ng to Be taproteobacteria was detected i n L533li brary,but
not i n L519li brary.M eanwh ile a c l one o f unclass ified bacte ria was detected i n L519library,but no t i n L533li brary.T he number o f opera ti ona l taxonom ic un its(OUT s)i n L519li brary and i n L533li brary w ere17and22respecti ve l y (P<0 05).F urt her m ore,t he frequenc ies of c l ones be l ong i ng to uncultured or unknown bacter ia i n L519library and i n
L533li brary w ere69 1%and76 6%respecti v ely(P<0 05).Con clusi ons Pr i m ers27F/533R w as mo re e ffecti ve t han
27F/519R i n ana l yz i ng the d i versity o fm icrobia l communities o f st oo l samp l es.
K ey words 16S rDNA;P r i m e rs;Stoo;l Community d i versity
基金项目:科技部卫生行业科研专项(项目编号:200802016)
作者单位:102206 北京,中国疾病预防与控制中心传染病预防与控制所
第一作者简介:李娟(1977-),女,博士,助理研究员,主要从事肠道病原菌快速检测工作
通讯作者:徐建国,Em ai:l xu ji anguo@ 近年来,对不同种属16s r DNA序列的大量测定及数据库的建立,为16S r DNA序列分析方法在细菌鉴定中的应用提供了可能。

各种基于16S r DNA 序列分析的菌种鉴定、种群多样性分析方法应运而生,大大提高了人们对目前人工难以模拟的生态环境中种群多样性的认识。

但该方法应用的重要前提
是扩增得到的16S靶序列忠实反映了原始样品的种群多样性。

DNA提取的效率、PCR扩增引物、扩增体系、扩增参数都会影响样品中种群的扩增效率,其中选择兼并性好的 通用引物 的是至关重要的。

在过去的30年,各国的研究者都在寻找兼并性更好的 通用引物 ,希望能够减少引物造成的偏差,最大程度的忠实反映样品的种群结构。

1994年Reysenbach 1 首次用27F/519R引物扩增细菌16S r D NA前500bp靶序列以来,被广泛应用于细菌种系发生学的研究,这对引物几乎能够扩增目前核糖体数据库(http://www.rdp.c m e. m /)中全部细菌的16S r DNA目的片段 2 。

然而,近几年发现一少部分种属的细菌,由于其在16S r DNA的保守区域发生了一定的变化,并不能被常用的 通用引物 (包括27F/519R)扩增得到。

为了降低引物保守区变化造成的扩增的偏袒, W atanabe设计比较了多对引物,其中引物27F/ 533R在罕见细菌的扩增上显示出明显的优势 3 。

在对地下水样品的分析中,27F/533R能检测到其他常用通用引物包括27F/519R不能检测到的疣微菌门(verr uco m icrob ia)菌株和未分类的细菌(cand i d a div i s ion OP11)。

但27F/533R引物是否适用于粪便标本,27F/519R和27F/533R引物在肠道菌群多样性分析时有无差异,目前还没有文献报道。

该研究中,选择27F/519R和27F/533R引物分别扩增同一份粪便样品DNA的16S r DNA,构建克隆文库,通过对两个克隆文库中菌群多样性的分析,比较两对引物对肠道菌群多样性分析的差异,为选择适宜引物进行肠道菌群多样性分析提供依据。

1 材料与方法
1.1 标本
粪便标本采集于一30岁健康女性,正常饮食,无腹痛、腹泻等消化道症状。

1.2 材料
DNA快速纯化回收试剂盒、T4DNA连接酶、T 载体试剂盒(PGE M-T easy)购自德国Pro m ega公司; Taq DNA聚合酶、dNTPs均为Ta K a Ra公司产品;培养基、化学试剂购自上海生工。

PCR仪(PTC-200)、凝胶成像系统(B io-Rad Gel Doc2000)均为伯乐公司产品。

Q I A a mp DNA S too lM ini K it(Q I A GEN)试剂盒购自Q I A GEN公司。

1.3 粪便标本总DNA的提取
分5点取粪便1g置于15m l无菌管中,加入磷酸盐缓冲液(p H7 2)10m,l震荡混匀,200转/分钟离心10m in,弃沉渣,混悬液震荡混匀加入溶菌酶37 孵育1h后,用Q I A a m p DNA Stool M i n i K it (Q I A GEN)提取粪便总DNA。

1.4 引物的选择
细菌16S r D NA扩增通用引物。

27F上游引物是相同的,分别用519R和533R做下游引物扩增目的片段(表1)。

表1 27F/519R和27F/533R引物序列引物序列
长度
(bp)
Ta值
( ) 27F:5 -AGAGTTTGATC M TGGCTCAG-3 2055
519R5 -GWATTACCGCGGCKGCTG-3 1854
533R5 -T I ACCGIIICT I CTGGCAC-3 1956
注:M:A or C;W:A or T;K:G or T;I:Inosi ne resi dues
1.5 目的片段的PCR扩增和纯化
PCR扩增条件为:94 预变性4m i n,94 变性1m in;50 退火1m in;72 延伸2m i n,30个循环后72 下延伸10m in。

使用DNA纯化试剂盒进行PCR产物的纯化。

两对引物的扩增条件相同。

1.6 克隆文库的构建及阳性克隆的筛选
纯化后的PCR产物通过T4连接酶连接到PGE M-T载体,将连接好的载体转化入J M109大肠杆菌感受态细胞。

在涂有X-gal和I PTG的氨苄青霉素的LB平板上进行蓝白斑筛选。

随机挑取克隆,采用特异引物T7和SP6的PCR扩增进行插入片段的筛选。

1.7 克隆的测序
随机选取65个阳性克隆进行测序,测序引物T7,测序工作由北京华大基因科技公司完成。

1.8 系统发育树的构建和统计学比较
运用C H ECK-C H I M ERA程序在RDP(R i b oso-m al Database Pr o ject)在线数据库进行嵌合体检验,去除嵌合及怪异序列。

运用B l a st程序将获得的序列在GenBank数据库中进行相似性搜索。

运用MEGA4 0软件构建系统发育树。

统计学分析用SAS软件 2检验完成。

2 结果与分析
2.1 粪便总DNA的提取
核酸提取是整个16S r DNA序列分析的基础,
能否获得具有代表性的核酸样品将决定后续分析的可信性。

对粪便标本来说,高质量的核酸样品包括三个方面,高效、均一和抑制物的去除。

目前针对粪便标本已开发出了多种商业化的试剂盒,其中Q I A -GE N 公司生产的Q I A a m p DNA Stoo lM i n iK it 试剂盒在保证核酸提取效率的同时可以有效的去除粪便中的植物性多糖类等抑制物,保证了实验结果的稳定性和可重复性。

但试剂盒中配备的裂解液对革兰氏阳性菌细胞壁裂解效果不理想。

在该实验中选用变溶菌素对粪便标本进行预处理,然后用Q I A a m p DNA Stoo lM i n iK it 试剂盒提取DNA,可以有效的提高革兰氏阳性菌的核酸提取量(数据尚未发表)。

通过该方法提取的DNA 大小主要集中在20kb,适
合进行后续实验。

图1 粪便提取总DNA 琼脂糖电泳图谱
M1:DL2000DNA 标准;1:粪便标本中提取的总DNA;M2:入噬菌-H i nd III 限制性内切酶酶切DNA 标准
2.2 PCR 扩增样品16S r D NA 基因
采用DNA 原液稀释的方法进行DNA 样品的PC R 扩增,浓度稀释倍数在10~100倍之间可以达到较理想的扩增效果。

该实验将DNA 原液稀释10倍,以5份DNA 样品为模板,用两对引物分别扩增16S r D NA 基因,每次PCR 反应设置3次重复,每对引物的15次重复的PCR 扩增产物混合后利用PCR 产物回收试剂盒回收。

结果均得到500bp 大小的条带。

将回收后的PC R 产物分别连接到PGE M-T 载体上用于16S r D NA 基因克隆文库。

2.3 克隆文库测序分析
2.3.1 27-f 519r 扩增产物克隆文库分析 随机挑选65个白色克隆,通过SP6-T7引物对PCR 扩增鉴定共有62个插入目的片段的克隆,阳性克隆率达到95 3%。

对上述62个阳性克隆进行测序分析。

运用C H ECK-C H I M ERA 程序在RDP 在线数据库进行嵌合体检验,并无明显的嵌合体情况出现。

62个克
隆子中64 3%OTUs 的序列与GenBank 数据库中未培养或不可培养细菌16S r DNA 序列同源性大于97%,仅有30 9%的克隆与G enB ank 数据库中已知细菌的16S r DNA 序列相似性大于97%,另外还有7.1%的克隆与GenBank 数据库中任何16S r DNA 序列的同源性小于97%。

把序列相似性大于等于98%的克隆定义为一个可操作分类单元(operati o na l taxono m ic un i,t OTU ),则62个克隆中共得到17个OTU s ,根据17个OTU s 的序列构建的系统发育树显示了OTUs 与菌株分类单元之间的聚类关系,来源于同一分类单元的OTUs 聚类在一起,OTU s 分支的多少代表该分类单元在L519文库中的复杂程度。

L519文库中梭状芽孢杆菌是最复杂的类群,包括位于同一个分支单元的8个OTU s 和一个独立分支的OTU s ;其次是拟杆菌,包括位于同一分支单元的5个OTU s ,聚类关系图同序列比对结果一致,再次揭示了文库的种群结构(图2a)。

2.3.2 27-f 533r 扩增产物克隆文库分析 随机挑选65个白色菌落,通过SP6-T7引物对PCR 扩增鉴定共有60个插入目的片段的克隆,阳性克隆率达到92 3%。

测序共得到60条16S r DNA 基因序列,其中65 9%的克隆与G enB ank 数据库中未培养或不可培养细菌16S r DNA 序列同源性大于97%,23 4%的克隆与GenBank 数据库中已知细菌的16S r DNA 序列相似性大于97%,还有10 6%的克隆与GenBank 数据库中任何16S r DNA 序列的同源性小于97%。

把序列相似性大于等于98%的克隆定义为一个可操作分类单元(OTU ),60个克隆中共得到22个OTU s ,系统发育树显示了L533文库的种群结构,梭状芽孢杆菌是最复杂的类群,其次是拟杆菌,芽孢杆菌、丙型变形杆菌和乙型变形杆菌类群简单,均只有一个OTU s 分支(图2b)。

2.3.3 两个克隆文库的种群分析和比较 L519克隆文库和L533克隆文库的种群结构基本相同,梭状芽孢杆菌纲为最优势菌群,分别占47 8%和50%;其次为拟杆菌纲,分别为43 5%和43 3%。

丙型变形菌纲和芽孢杆菌纲为1%~5%(表1)。

两个文库中,均只有少部分的克隆和GenBank 数据库中已知细菌的16S r DNA 序列相似性大于97%,大部分克隆与未培养细菌或不可培养的细菌同源性大于97%,还有一小部分克隆与GenBank 数据库中任何16S r DNA 序列的同源性小于97%。

在L519文库
中,非培养或未知细菌的克隆占69 1%,在L533文库中,则达到了76 6%,P <0 05。

聚类关系图显示,L533文库和L519文库分别有22个和17个分支,L533文库比L519文库有更丰富的种群多样性
(P <0 05),提示引物533R 比引物519R 具有更好的兼并性,在肠道菌群分析中能够得到更丰富的菌
群多样性。

图2 基于16S r DNA 区序列构建的N -J 系统树,显示L 519文库(a)和L533文库(b)中可操作分类单元与之间的关系;高于50%的Bootstrap 值被显示,标尺标示分支长度,
可操作分类单元编号后的字母代表序列来源菌株的系统分类地位。

表2 L519、L 533克隆文库种群结构分析
分类地位
L533文库种群结构
数量
比例
(%)
L519文库种群结构数量比例(%)
梭状芽孢杆菌纲C lostridia
FCCL 1(1.67)1(1.61)FCCLR 3(5.00)4(6.45)FCC -1(1.61)FCCR 1(1.67)31(51.67)-29(47.8)FCCRF 19(31.67)17(27.42)
FCCRS 1(1.67)-FCCVM
6(10.00)6(9.68)拟杆菌纲B actero i detes BBBBB 25(41.67)25(41.67)27(43.5)27(43.5)芽孢杆菌纲B acilli
FBLSS 2(3.33)2(3.33)2(3.22)2(3.22)丙型变形菌纲Ga mmaproteobact eri a PGEE 1(1.67)1(1.67)3(4.83)3(4.83)乙型变形菌纲B etap roteobacteri a PBB 1(1.67)1(1.67)--未分类uncl assifi ed bacteria
B
--1(1.61)
1(1.61)合计
60(100)
62(100)
注:FCCL :厚壁菌门,梭状芽孢杆菌纲,梭状芽孢杆菌目,毛螺旋菌科;FCCLR :厚壁菌门,梭状芽孢杆菌纲,梭状芽孢杆菌目,毛螺旋菌科,罗斯氏菌属;FCC:厚壁菌门,梭状芽孢杆菌纲,梭状芽孢杆菌目;FCCR:厚壁菌门,梭状芽孢杆菌纲,梭状芽孢杆菌目,Ru m i nococcaceae ;FC -CRF :厚壁菌门,梭状芽孢杆菌纲,梭状芽孢杆菌目,Rum i nococcaceae ,Faecali b acteri um ;FCCRS:厚壁菌门,梭状芽孢杆菌纲,梭状芽孢杆菌目,Rum i nococcaceae ,Subdoligranu l u m ;FCCVM:厚壁菌门,梭状芽孢杆菌纲,梭状芽孢杆菌目,韦荣氏球菌科,巨球菌属;BBBB:拟杆菌门,拟杆菌纲,拟杆菌目,拟杆菌科,拟杆菌属;FBLSS:厚壁菌门,芽孢杆菌纲,乳酸菌目,链球菌科,链球菌属;PGEE:变形菌门,丙型变形菌纲,肠杆菌目,肠杆菌科;PBB :变形菌门,乙型变形菌纲,伯克氏菌目;B :未分类细菌
3 讨论
16S r DNA克隆文库方法无需分离培养,为研究目前实验室不可模拟条件下的种群结构和系统发育状况提供了强有力的工具,大大增加了人们检测和鉴定环境中 非培养 微生物的能力,已被广泛地应用到水体、土壤、海洋沉积物、生物水处理系统等的细菌多样性研究 4-6 ,极大地丰富了环境微生物资源库,并用于指导细菌的分离培养。

但是基于16S r DNA PCR扩增的种群结构分析方法依赖于对原始样品的忠实反映。

由于PCR反应呈指数扩增,引物的微小偏袒会使扩增后产物严重背离原始样品。

目前还没有哪对引物可以扩增所有细菌的16S r DNA 7,8 。

W atanabe 3 等报道,利用不同的引物扩增16S r DNA靶序列,菌群多样性结果是不同的。

对不同的样品应该选择不同的引物进行扩增。

因此,针对不同样品中菌群结构的特点,选择通用的、适宜的引物,尽可能地减少对原始样品菌群多样性的偏差,是成功应用非培养16S r DNA克隆文库方法进行菌群多样性研究的重要前提。

该实验中改进了粪便DNA的提取方法,得到了高质量的DNA,用两对引物分别扩增,成功构建了L519克隆文库和L533克隆文库,阳性克隆率达到了92%以上。

两个文库中,肠道优势种群如梭状芽孢杆菌纲、拟杆菌纲和芽孢菌纲比例相同,在低丰度菌群的组成上,两个克隆文库不尽相同;在种群多样性上L533克隆文库比L519克隆文库有更多的OTU s。

提示L519R和L533R引物在与16S r DNA 模板的结合力上是有种属差异的,两条引物各有偏颇。

虽然优势菌群高拷贝模板掩盖了两对引物结合力上的差异,在非优势菌群中还是可以明显看到两对引物扩增微量DNA模板时的差异。

由于测序数量有限而且肠道内70%以上的种群是目前难培养或不可培养的,因而目前还不能确定两对引物各自优先扩增的类群。

但仍然可以看出对肠道菌群533R引物比519R引物有更好的兼并性,显示出更高的种群多样性,为今后选择16S r DNA引物开展粪便标本种群分析、病原检测等研究提供了基础依据。

该实验中,两个克隆文库分别只挑取了65个克隆,虽然能够看出,533R引物比519R引物更具有兼并性,但两者有多大的差别,检测的下限能够达到多少还不清楚。

要回答这些问题还需要扩大测序量进行进一步的研究。

近两年,第二代测序技术的迅猛发展在实现高通量测序的同时大大降低了测序费用,给种群多样性的分析带来了契机,但也对 通用引物 的兼并性提出了更高的要求。

目前,第二代测序技术的典型代表454、So lexa已在国内的部分测序公司投入使用,在下一步的实验中,将在不同的样品中用454测序技术对引物27F/533R的兼并性进行更深入的评价。

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(收稿日期:2010-05-05)
(本文编辑:宋晓东)。