高效液相色谱法测定虫草发酵液与菌丝体核苷化合物含量

医药界　2020年04月第08期
—60—
医药与临床
高效液相色谱法测定虫草发酵液与菌丝体核苷化合物含量
翟　玲
（江西国药有限责任公司，江西　南昌　330052）
【摘要】目的：本文使用高效液相色谱仪器对戴氏虫草、江西虫草和古尼虫草的发酵液和菌丝体中核苷类化合物进行检测。

通过实验考察，结果表明，建立的方法具有结果重现性好、精密度高的特点。

从检测结果来看，戴氏虫草菌丝体的商业价值最高。

【关键词】虫草；高效液相色谱；菌丝体；核苷
【中图分类号】R 284 【文献标识码】A 【文章编号】
2095-4808（2020）08-060-011.前言
受到地区、人口与经济发展的限制，天然冬虫夏草产量一直很难满足广大居民医疗、保健需求。

研究表明，人工繁育的发酵虫草菌丝体化学组成与天然虫草有一定差距，但是在临床医学上表现出了相似的医疗效果。

其所含有的核苷类化学物质在抑制人体血液中血小板凝聚具有显著功效。

本文选择高效液相色谱法对人工发酵培养的冬虫夏草菌丝粉和发酵液中的各种核苷化合物进行定性、定量检测。

2.实验过程
1、实验试剂,化学试剂：实验使用的标准试剂包括了腺苷、虫草素、肌苷、尿苷、鸟苷采购于中国药品生物制品检定所；甲醇、乙醇化学试剂采购于阿拉丁公司，纯度为色谱纯，其他试剂为分析纯。

样品试剂：实验使用的虫草发酵菌丝体样品来源于贵州省遵义医学院细胞工程重点实验室；
2、实验仪器,实验使用的高效液相色谱仪器采购于日本Shimadzu 公司，型号为LC-20A；实验使用的全温震荡培养设备，采购于浙江太仓华美仪器有限公司，幸好为QHZ-90A；实验使用的超纯水仪采购于法国Millipore 公司，型号为MER-300B；实验使用的电热恒温干燥箱采购于上海博迅实业有限公司医疗设备分公司，型号为GZX-9070 MBE；实验室用的冷冻高速离心机采购于德国Eppendorf 公司，型号为CentrifuGe 5804R；实验使用的旋转蒸发仪采购于瑞士BUCHI 公司；
3、色谱工作参数,色谱使用的色谱柱为反相结合的ODS 液体-液体型色谱柱，ODS Hypersil 5μm，125×4 mm，色谱柱前加Shimadzu C 18保护柱子。

流动相：色谱纯甲醇；检测器：二极管阵列检测器（DAD），检测器设定的扫描波长为190-560nm，检测波长为254nm；色谱柱温度：35℃；流动相流速：1.0mL/min；进样：每次自动进样20
μL。

在此条件下对五种核苷标准试剂混合样品进行检测（如图1所示），特征峰峰型尖锐、特征峰之间没有重叠，计算的色谱理论塔板数大于2500。

图1 标准样品高效液相色谱检测谱图
4、供试品制备,（1）菌丝体供试品制备：将购买的菌丝体粉碎并用80目筛网过筛，准确称量1.000G 样品加入10mL 超纯水进行超声分散1h，利用高速离心机对溶液进行离心，收集上清液。

对沉积物进行重复分散、离心。

反复进行3此后，使用0.22μm 纤维滤膜对溶液进行过滤，得到的滤液使用50mL 容量瓶定容。

（2）发酵液供试品制备：利用高速离心机对发酵液进行离心，收集上清液。

对沉积物进行重复分散、离心。

反复进行3此后，使用0.22μm 纤维滤膜对溶液进行过滤，得到的滤液使用50mL 容量瓶定容。

3.结果与讨论
1、线性关系、检测限和定量限考察,准确称取物种核苷标准样品1mG，使用超纯水在10mL 容量瓶中定容。

分别移取0.05-2.5mL 标准溶液进行稀释定容，得到一系列浓度梯度标准溶液（0.001、0.005、0.01、0.0
2、0.05、0.1mG/mL）。

以蓟县噪声的3倍和10倍树脂分别表示样品的检出限和定量限。

检测结果如表1所示。

表1 五种核苷化合物的标准曲线方程及检测限和定量限
组分
回归方程
相关系数线性范围/mG 检出限定量限尿苷Y=6.135×107X-22830.99981.0-1000.0120.037鸟苷Y=1.082×108X-58200.99981.0-1000.2300.78肌苷Y=8.676×107X+20720.99971.0-1000.0160.050腺苷Y=7.470×107X 40840.99981.0-1000.1200.400虫草素
Y=6.346×107X-1882
0.99991.0-100
0.018
0.060
2、精密性和峰纯度,准确移取标准试剂溶液20μL，连续进样7次，根据信
号峰强度计算平行实验的RSD（n=7），考察本方法的精密度。

计算结果表明，尿苷、鸟苷、肌苷、腺苷、虫草素的RSD 分别为0.920%、0.15%、0.78%、0.87%、0.61%，说明检测方法精密度较高。

3、样品溶液化学稳定性考察,以戴氏虫草为样品进行样品制备。

以完成制备样品时开始计时，在0、2、4、8、16、24时间下对统一样品该溶液进行检测，考察样品的存放寿命。

结果表明，样品中尿苷、鸟苷、肌苷、腺苷的RSD 分别为2.14%、1.67%、3.56%、3.09%。

RSD 数值可以控制在5%以下，说明样品在24h 时间内均具有检测活性。

虫草素未检测出数据。

4、样品重现性,以江西虫草为样品，配置7组样品溶液，分别进行样品检测，计算样品检测结果的RSD，考察本方法对实际样品检测结果的重现性。

结果表明，样品中的尿苷、鸟苷、肌苷、腺苷、虫草素的含量分别为3.15mG/G、0.11mG/G、未检出、1.60mG/G、未检出；重复性检测结果计算的RSD 值分别为2.84%、4.04%、2.44%。

5、样品重现性,对戴氏虫草菌丝体、戴氏虫草发酵液、江西虫草菌丝体、古尼虫菌丝体四种样品检测，检测结果：四种样品均为检测出由虫草素存在。

戴氏虫草发酵液中未检测出由肌苷，而鸟苷、尿苷和腺苷的含量也远远低于戴氏虫草菌丝体的。

而江西虫草和古尼虫草菌丝体中分别有鸟苷和肌苷核苷组成的缺失，说明从医药价值来看，戴氏虫草的有效组成种类、含量最高，商业价值较高。

4.结果
本文利用高效液相色谱检测仪器选择性好、灵敏度高、分析速度快的特点，建立了虫草发酵样品中五种核苷类样品的检测方法，结果表明，建立的方法具有结果重现性好、精密度高、样品的特点。

参考文献
[1] 陆巍杰, 唐永范, 唐亮, et al. 北冬虫夏草、冬虫夏草及食用菌中核苷类功
效成分的比较研究[J]. 中国科技产业, 2012(9):54-57.
[2] 梅雪艳, 李媛媛, 沈于兰. 冬虫夏草、虫草菌丝体及蛹虫草中核苷类成分的
测定[J]. 药学与临床研究, 2015(1).
作者简介：姓名：翟玲（1985.01--）；性别：女，籍贯：江西省南昌人，学历：硕士，毕业于南昌大学；现有职称：中级工程师；研究方向：制药工程。

（上接第58页）
分组n 入组时治疗后观察组3762.79±5.3789.95±11.02对照组37
63.06±5.2775.28±6.39t 值0.18910.295p 值
0.2180.000
3.讨论
慢性浅表性胃炎近年来在我国临床中具有较高发病率，该疾病的病程时间较长，同时容易反复性发作，也对患者患病期间生命质量产生较大影响[2]。

该疾病的发病原因十分复杂，例如幽门螺杆菌感染、身心因素、病毒、吸烟以及代谢功能
障碍等[3]。

中医则认为该疾病的病因在于日常饮食不节、
脾胃虚弱以及情志失调等，使得患者脾胃功能发生失调，虽然该疾病病位于胃，然而也与脾、肝具有密切相关性，患者的病机在于脾胃虚弱以及脾胃功能失调，在治疗中还需坚持健运脾胃以及温中散寒的原则。

针灸疗法属于中医经典外治疗法，并且在慢性胃炎患者
的治疗中也具有广泛的应用，可发挥良好疗效[4]。

这次研究中，
针对观察组运用温针灸疗法治疗取得满意疗效，经对比观察组的总体治疗有效率高于对照组，同
时治疗后生命质量测评得分改善效果好于对照组。

表明，温针灸疗法在慢性浅表
性胃炎（脾胃虚弱型）患者治疗中具有较高的应用价值。

温针灸治疗中将针刺和艾灸两者有机结合，发挥温通经脉以及行气活血等功效。

同时有研究发现，温针灸过程中能够对患者脏腑功能与神经通路产生良好的调节作用，帮助改善新陈代谢并提升机体免疫能力，有利于促使胃肠系统分泌，并发挥胃黏膜和胃肠运动的保护与调节功能。

综上所述，对于脾胃虚弱型的慢性浅表性胃炎者，通过运用温针灸治疗可有效改善患者的临床症状，并提高生命质量水平。

参考文献
[1] 戚锦丽,黄柳和.温针灸与常规针灸治疗脾胃虚弱型慢性浅表性胃炎的临床疗
效对比[J].内蒙古中医药,2019,38(12):139-140.
[2] 陈彭梦影？.温针灸对脾胃虚弱证慢性浅表性胃炎患者症状改善及生命质量
的影响[J].中国处方药,2019,17(09):135-136.
[3] 李红君,李文东,陈光华,魏莹,刘福.逆萎促愈汤联合温针灸治疗慢性萎缩性
胃炎的临床疗效及对血管内皮因子的影响[J].四川中医,2019,37(07):119-122.[4] 袁珍珍,廖安,廖金平,钟毅.生胃散联合温针灸对慢性萎缩性胃炎的疗效以
及对血清胃蛋白酶原水平的影响[J].成都中医药大学学报,2018,41(01):60-63.
（上接第59页）
现代医疗工作对药物应用的要求极高，大部分疾病需要通过药物进行控制，这也要求医疗机构提升自身药品管理水平。

此前学者在研究中发现，常规护理模式下，药房药品管理问题发生率在5%-8%左右，包括存放位置混乱、信息不完善
等等[1]。

给予持续质量改进管理，
各类药品管理问题发生率可下降在3%以下[2]。

我院研究结果与此相似，观察组药房药品管理问题发生率为2.00%，低于对照组的7.00%。

从思路上看，我院重视通过回顾性分析了解导致药房药品管理问题的独立性因素，并据此开展管理工作。

工作人员对药品功能、存放管理工作流程不够熟练可直接引发管理问题，管理模式的落后影响信息交互效率，也影响人员的知识掌握。

监督不到位则使现有问题无法得到察觉和处理。

我院据此给予加强培训、更新模式、加强监督三项措施，加强培训提升了药房工作人员的专业能力，小组模式可稳定、持续保持培训效果得到发挥。

更新的工作模式引入了信息化模块，有助于线上、线下工作的同步开展，且信息化模式借助现代设备、通信网络
进行，具有较高的持续性，能够满足长时间工作、持续改进质量的要求。

监督的加
强着眼于工作模式的更新，分别从线上、线下两个方面开展工作，保证药品信息准确无误，存放管理、库存管理高效有序，综合提升药房药品管理工作质量。

值得注意的是，持续质量改进需要强调措施的稳定、长期推行，且应重视推行过程中的检查、优化，以保证管理工作始终能够契合药房工作需求。

综上所述，持续质量改进理念和措施的运用，有助于提高药房药品管理质量，后续工作中可予以推广。

参考文献
[1] 林锐娜.PDCA 循环管理法在重点管理类药品管理中的应用价值[J].中国药物
经济学,2019,14(06):110-112.
[2] 袁闻清,聂新华,徐平.PDCA 循环管理的建立对于住院药房中的作用分析[J].
北方药学,2019,16(07):159+158.。