血红蛋白的提取与分离讲课文档
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第二十二页，共31页。
50cm高
（3）样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与 凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时， 吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床 内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
3.类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。
第十一页，共31页。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 所带电荷相反的电极移动
琼脂糖凝胶电泳示意图
第十二页，共31页。
聚丙稀酰胺凝胶电泳
1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠 （SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶是 由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引 发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状 结构的凝胶。
3.凝胶色谱法的原理—分子筛效应：
①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分 子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长， 移动速度较慢;②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝 胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动 速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分 离。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。
3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：①样品的预处理 ②色谱柱填料的处理
和色谱柱的装填。
第二页，共31页。
2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成，这标志着 进入了后基因组和蛋白质组时代
人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息
蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是 对蛋白质功能的研究
第二十三页，共31页。
（3）样品加入与洗脱
注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、 贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
第二十四页，共31页。
思考下面的问题：
1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是 什么？ 让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。
2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行 蛋白质得分离有什么意义？
第十三页，共31页。
聚丙稀酰胺凝胶电泳
2.原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决
于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。
（SDS的作用）为了消除净电荷对迁移率的影响，
可以在凝胶中加入SDS。
3. SDS作用机理:
SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋
白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此 测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白 质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大 超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白 质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大 小。
第十六页，共31页。
二、实验操作
(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加 40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分 钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液：
①过程：将搅拌好混合液转移到离心 管内，以2000r/min的速度离心10 min。 ②试管中溶液层次：第1层（最上层）： 甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）： 脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第 3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层 （红色透明液体）；第4层（最下层）： 杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸
强酸的称为共轭碱。这一共轭酸碱通常称为缓冲对 缓冲剂或缓冲系。常见的缓冲对主要有如下
三种类型：
①弱酸及其对应的盐：
H2CO3→NaHCO3 ；CH3COOH→CH3COONa ②弱碱及其对应的盐：
NH3•H2O→NH4CL ; NH4OH→NH4CL ③多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐:
NaHCO3→Na2CO3 ；NaH2PO4→Na2HPO4
血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜 色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常 直观，大大简化了实验操作。
3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、 粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、 离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析 去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法 将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯 酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
液 血细
胞
白细胞 血小板 红细胞
两个α－肽链 血红蛋白 两个β一肽链
（最多） （90％） 四个亚铁红素基团
第四页，共31页。
血红蛋白的特点：
每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，
此基团可携带一分子氧或一分子二
氧化碳，血红蛋白因含有血红素而
呈红色。
血红蛋白
第五页，共31页。
两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁红素基团
第十页，共31页。
（三） 电泳：
1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、
核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这 些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下， 这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移 动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性 质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使 带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中 各种分子的分离。
第二十五页，共31页。
（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.目的： 鉴定血红蛋白纯度。
2.试剂的配制：
①丙烯酰胺和N, N-甲叉双丙烯酰胺: 用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液。
②十二烷基硫酸钠（SDS）: 用去离子水配成10%的贮存液，于室温 保存。③用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液。④TEMED ：作用 通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚 合。⑤用去离子水配制10% 过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和 双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。⑥Tris— 甘氨酸电泳缓冲液：25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH
第十四页，共31页。
用SDS测定蛋白质分子量的方法
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋 白质的分子量时，可选用一组已知分子量 的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子 量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁 移率和分子量的对数作标准曲线，可以测 定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子 量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试 剂出售。
③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固 定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色 谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意： 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱 液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
第二十一页，共31页。
血红蛋白的提取与分离
第一页，共31页。
本课题学习目标
体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过 程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生 物大分子的基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④它们 在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。
2.主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电泳法 分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理
第七页，共31页。
4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程
第八页，共31页。
（二）缓冲溶液
1.概念: 在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强 酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混
合溶液。
2.作用: 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，
维持PH基本不变。
3.缓冲溶液的配制通: 常由1－2 种缓冲剂溶解于水
第三页，共31页。
1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提 取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的 提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量 丰富，便于提取血红蛋白。
2.提问：血液有哪些成分？
水分 血浆
血红蛋白
血
固体物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等
过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静 置片刻后，分出下层的红色透明液体。
第十七页，共31页。
试管中溶液层次
甲苯层（无色透明） 白色薄层固体
红色透明液体
杂质沉淀层（暗红色）
第十八页，共31页。
(4)透析：
二、实验操作
①过程：取1ml的 血红蛋白溶液装入 透析袋中，将透析 袋放入盛有300ml 的物质的量浓度为 20mmol/l的磷酸缓 冲液中（pH为 7.0），透析12小 时。②透析目的： 除去样品中分子量 较小的杂质。
使微生物的蛋白质发生变性、蛋白质的空间结构被破
坏。
第六页，共31页。
（一） 凝胶色谱法（分配色谱法）
1.概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大 小，
利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行 分离。
2.凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或
琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。
④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连
接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出 液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区 带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）
⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
第十九页，共31页。
2.凝胶色谱操作: （1）凝胶色谱柱的制作：
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网， 再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插
入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网， 还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻 璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他 附属结构。
一、血红蛋白的提取和分离
1.分离生物大分子的基本思路：
选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理 或化学性质的生物大分子。
2.蛋白质分离和提取的原理：
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、 所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分 子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
3.高温灭菌和酒精灭菌的结果：
（2）凝胶色谱柱的装填
④洗涤平衡：装填完毕后，
立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高 的操作压下，用300ml的20mmol/l 的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗
涤平衡12小时。注意：1、液面 不要低于凝胶表面，否则可能 有气泡混入，影响液体在柱内 的流动与最终生物大分子物质 的分离效果。2、不能发生洗脱 液流干，露出凝胶颗粒的现象。
中配制而成。调节缓冲剂的使用比例的缓冲液是:____磷__酸__缓__冲, 液
其目的是: 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科 学研究(活性)
第九页，共31页。
缓冲溶液的组成及分类
缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，能对 抗外来强碱的称为共轭酸；能对抗外来
第二十页，共31页。
（2）凝胶色谱柱的装填
①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及 分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水 7.5克。
②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一
定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶 悬浮液。
第十五页，共31页。
二、实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
（二）操作过程
1.样品处理： 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。
(1)红细胞的洗涤:
①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化，洗涤次数不可过少。
②洗涤操作： 1、采集血样。2、低速短时间离心 （速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一 同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明 的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为 0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间） 6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表 明洗涤干净。
50cm高
（3）样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与 凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时， 吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床 内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
3.类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。
第十一页，共31页。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 所带电荷相反的电极移动
琼脂糖凝胶电泳示意图
第十二页，共31页。
聚丙稀酰胺凝胶电泳
1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠 （SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶是 由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引 发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状 结构的凝胶。
3.凝胶色谱法的原理—分子筛效应：
①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分 子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长， 移动速度较慢;②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝 胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动 速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分 离。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。
3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：①样品的预处理 ②色谱柱填料的处理
和色谱柱的装填。
第二页，共31页。
2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成，这标志着 进入了后基因组和蛋白质组时代
人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息
蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是 对蛋白质功能的研究
第二十三页，共31页。
（3）样品加入与洗脱
注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、 贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
第二十四页，共31页。
思考下面的问题：
1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是 什么？ 让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。
2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行 蛋白质得分离有什么意义？
第十三页，共31页。
聚丙稀酰胺凝胶电泳
2.原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决
于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。
（SDS的作用）为了消除净电荷对迁移率的影响，
可以在凝胶中加入SDS。
3. SDS作用机理:
SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋
白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此 测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白 质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大 超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白 质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大 小。
第十六页，共31页。
二、实验操作
(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加 40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分 钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液：
①过程：将搅拌好混合液转移到离心 管内，以2000r/min的速度离心10 min。 ②试管中溶液层次：第1层（最上层）： 甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）： 脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第 3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层 （红色透明液体）；第4层（最下层）： 杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸
强酸的称为共轭碱。这一共轭酸碱通常称为缓冲对 缓冲剂或缓冲系。常见的缓冲对主要有如下
三种类型：
①弱酸及其对应的盐：
H2CO3→NaHCO3 ；CH3COOH→CH3COONa ②弱碱及其对应的盐：
NH3•H2O→NH4CL ; NH4OH→NH4CL ③多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐:
NaHCO3→Na2CO3 ；NaH2PO4→Na2HPO4
血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜 色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常 直观，大大简化了实验操作。
3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、 粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、 离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析 去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法 将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯 酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
液 血细
胞
白细胞 血小板 红细胞
两个α－肽链 血红蛋白 两个β一肽链
（最多） （90％） 四个亚铁红素基团
第四页，共31页。
血红蛋白的特点：
每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，
此基团可携带一分子氧或一分子二
氧化碳，血红蛋白因含有血红素而
呈红色。
血红蛋白
第五页，共31页。
两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁红素基团
第十页，共31页。
（三） 电泳：
1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、
核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这 些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下， 这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移 动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性 质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使 带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中 各种分子的分离。
第二十五页，共31页。
（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.目的： 鉴定血红蛋白纯度。
2.试剂的配制：
①丙烯酰胺和N, N-甲叉双丙烯酰胺: 用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液。
②十二烷基硫酸钠（SDS）: 用去离子水配成10%的贮存液，于室温 保存。③用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液。④TEMED ：作用 通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚 合。⑤用去离子水配制10% 过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和 双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。⑥Tris— 甘氨酸电泳缓冲液：25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH
第十四页，共31页。
用SDS测定蛋白质分子量的方法
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋 白质的分子量时，可选用一组已知分子量 的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子 量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁 移率和分子量的对数作标准曲线，可以测 定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子 量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试 剂出售。
③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固 定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色 谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意： 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱 液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
第二十一页，共31页。
血红蛋白的提取与分离
第一页，共31页。
本课题学习目标
体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过 程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生 物大分子的基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④它们 在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。
2.主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电泳法 分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理
第七页，共31页。
4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程
第八页，共31页。
（二）缓冲溶液
1.概念: 在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强 酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混
合溶液。
2.作用: 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，
维持PH基本不变。
3.缓冲溶液的配制通: 常由1－2 种缓冲剂溶解于水
第三页，共31页。
1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提 取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的 提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量 丰富，便于提取血红蛋白。
2.提问：血液有哪些成分？
水分 血浆
血红蛋白
血
固体物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等
过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静 置片刻后，分出下层的红色透明液体。
第十七页，共31页。
试管中溶液层次
甲苯层（无色透明） 白色薄层固体
红色透明液体
杂质沉淀层（暗红色）
第十八页，共31页。
(4)透析：
二、实验操作
①过程：取1ml的 血红蛋白溶液装入 透析袋中，将透析 袋放入盛有300ml 的物质的量浓度为 20mmol/l的磷酸缓 冲液中（pH为 7.0），透析12小 时。②透析目的： 除去样品中分子量 较小的杂质。
使微生物的蛋白质发生变性、蛋白质的空间结构被破
坏。
第六页，共31页。
（一） 凝胶色谱法（分配色谱法）
1.概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大 小，
利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行 分离。
2.凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或
琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。
④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连
接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出 液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区 带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）
⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
第十九页，共31页。
2.凝胶色谱操作: （1）凝胶色谱柱的制作：
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网， 再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插
入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网， 还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻 璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他 附属结构。
一、血红蛋白的提取和分离
1.分离生物大分子的基本思路：
选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理 或化学性质的生物大分子。
2.蛋白质分离和提取的原理：
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、 所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分 子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
3.高温灭菌和酒精灭菌的结果：
（2）凝胶色谱柱的装填
④洗涤平衡：装填完毕后，
立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高 的操作压下，用300ml的20mmol/l 的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗
涤平衡12小时。注意：1、液面 不要低于凝胶表面，否则可能 有气泡混入，影响液体在柱内 的流动与最终生物大分子物质 的分离效果。2、不能发生洗脱 液流干，露出凝胶颗粒的现象。
中配制而成。调节缓冲剂的使用比例的缓冲液是:____磷__酸__缓__冲, 液
其目的是: 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科 学研究(活性)
第九页，共31页。
缓冲溶液的组成及分类
缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，能对 抗外来强碱的称为共轭酸；能对抗外来
第二十页，共31页。
（2）凝胶色谱柱的装填
①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及 分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水 7.5克。
②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一
定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶 悬浮液。
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二、实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
（二）操作过程
1.样品处理： 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。
(1)红细胞的洗涤:
①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化，洗涤次数不可过少。
②洗涤操作： 1、采集血样。2、低速短时间离心 （速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一 同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明 的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为 0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间） 6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表 明洗涤干净。