三种不同银纳米粒子SERS基底比较研究

三种不同银纳米粒子SERS基底比较研究
邓悦;吴世法;李睿;丁建华;张毅
【摘要】表面增强拉曼光谱(SERSp)技术是一种新兴的分析检测技术,由于其对样品分析灵敏度高、检测时间短以及样品所需量小等优点,近年来该技术已在生物医学,化学等领域得到广泛的应用,同时表面增强拉曼散射(SERS)基底的制备已成为该领域的研究热点.本文主要对三种以银纳米粒子(AgNPs)的SERS效应为基质的拉曼活性基底:毛细管-AgNPs,二氧化钛-AgNPs和滤纸-AgNPs进行比较研究.首先分别用三种基底对罗丹明6G(R6G)分子进行拉曼光谱采集及分析,找出三种SERS基底相应的最佳制备条件.最后用这三种最佳条件下制备的SERS基底对同一个健康人血清进行拉曼光谱检测,并对结果进行分析比较.初步结果:三种SERS基底都是可靠的和实用的;二氧化钛-AgNPs基底灵敏度相对较高,但制备过程较复杂;滤纸-AgNPs基底灵敏度其次;毛细管-AgNPs基底及滤纸-AgNPs基底的制备均较为简单.因此,从实用角度考虑,滤纸-AgNPs基底比较适合血清的表面增强拉曼光谱检测与分析.
【期刊名称】《光散射学报》
【年(卷),期】2015(027)003
【总页数】8页(P231-238)
【关键词】表面增强拉曼散射;毛细管;二氧化钛;滤纸;银纳米粒子;血清
【作者】邓悦;吴世法;李睿;丁建华;张毅
【作者单位】大连理工大学物理与光电工程学院,大连116024;大连理工大学物理与光电工程学院,大连116024;大连理工大学物理与光电工程学院,大连116024;大
连理工大学物理与光电工程学院,大连116024;大连理工大学物理与光电工程学院,
大连116024
【正文语种】中文
【中图分类】O433.4
拉曼光谱技术是以拉曼效应为基础建立起来的以光子作探针、具有实时检测特点的分子结构表征技术,而表面增强拉曼散射是由于金属表面局域等离子体激元共振引
起的电磁增强,以及金属纳米结构和吸附分子之间相互作用引起的化学增强共同作
用导致的散射增强现象,是一种非常有效的检测拉曼信号的技术,在光谱分析、生物
医学等领域有着广泛的应用。

SERS信号的增强很大程度上取决于SERS基底的形状、尺寸、以及基底与探测分子之间的吸附特性。

SERS基底的制备已成为该领域的研究热点。

人们不再局限于将SERS活性材料银粒子滴加在玻璃片或硅片上来应用,而是极大地拓展了SERS活性材料银粒子的负载物,这包括毛细管、金属氧化物、纸质SERS基底等。

此外,拉曼光谱检测血清也是目前研究最活跃的领域之一,它可
以在分子水平反应组织、细胞的化学成分和分子结构的差异,具有快速、准确、客观、无损等特点[1-2]。

目前,SERS基底的制备以及在血清检测中的应用,国内外已有许多相关的文献报道。

邵名望等人[3]提出利用毛细作用来制备SERS基底的方法。

在毛细管内壁简单修
饰可以与贵金属纳米颗粒结合的有机分子来提供结合位点,通过毛细作用将贵金属
的纳米颗粒溶胶“吸入”其内壁进行修饰获得SERS基底。

郭丽等人[4]曾利用此
基底对血清的表面增强拉曼光谱进行了分析研究。

将TiO2与贵金属结合,制备复合型SERS基底的方法已有很多。

如刘伟[5]的金属@TiO2复合纳米粒子的制备,陈亚杰[6]的Ag修饰单层多孔锐钛矿型TiO2纳米带的制备等等。

所有报道制备TiO2-AgNPs的方法中,光催化还原法是简单、有效的方法,此方法中,Ag离子通过光生电
子被还原到TiO2表面[7-14]。

目前,对于该方法制备的TiO2-AgNPs基底,TiO2薄膜厚度及形态对光催化还原过程中AgNPs增长的影响及相应的SERS效应已有一定的研究[15],但将其作为SERS基底,实现对血清的检测,尚未有研究报道。

由于滤纸具有微米级的粗糙度和相互交错的纤维结构,用自组装的方法,在其表面吸附银纳米粒子形成一层纳米级的银薄膜,构造灵敏度高、制作简单、易实现微型化和阵列化的SERS活性基底,国内外已有一些相关研究,如:欧阳雨等[16]的层析滤纸拉曼光谱特性研究;张文译等[17]以滤纸的多级纤维结构为基底,通过物理气相沉积(PVD)方法蒸镀一定厚度的银膜,制备了表面增强拉曼试纸等等。

目前,已有通过自组装技术,将银溶胶吸附到具有微米级纤维结构的滤纸表面,制得银粒子膜作为SERS基底,并将其应用于化学和生物分子的分析检测中[18],但将此银溶胶与滤纸结合制备的SERS基底应用到血清的检测中,尚未有研究报道。

本文主要对三种常用的SERS基底:毛细管-AgNPs,TiO2-AgNPs及滤纸-AgNPs,分别从制备方法、对染料分子罗丹明6G拉曼光谱检测及对同一个健康人血清的拉曼光谱检测进行了研究,并进行分析比较,找出三种基底用于血清拉曼光谱检测的优缺点,为下一步找出更适合人体血清检测的SERS基底提供有用的参考。

2.1 实验仪器、实验条件、实验试剂及样品
实验仪器:RENISHAW(INVIA)拉曼光谱仪(配置德国Zeiss Axiovert25倒置显微镜,分辨率为2 cm-1;光源为He-Ne激光器,激发波长为632.8 nm,激光功率为35 mW)、电子分析天平(QS104)、磁力加热搅拌器(CJJ-781)、数显恒温水浴锅、JJ-1精密增力定时调速电动搅拌机、离心机(TG16-WS)、震荡仪(SYM.BIO)、镀膜提拉机(ZR-4200)、紫外灯、格兰仕家用微波炉、超声波振荡器(KQ118型)。

实验条件:用半导体硅片(520 cm-1)定标。

将不同的SERS基底制成的样品放在与拉曼光谱仪相连接的倒置显微镜的可移动平台上,曝光时间为10 s,用40×物镜进行聚焦,采用180°的背散射的接收方式,血清拉曼光谱检测扫描范围为300～2200
cm-1,因为该光谱范围是富含生物信息的指纹区,每个样品选择10个左右测试点采集数据,平均取值。

实验试剂及样品:柠檬酸三钠、硝酸银、钛酸丁酯、乙酰丙酮、丙酮、酒精、硝酸、去离子水、罗丹明6G、层析滤纸、载玻片,以上试剂均为分析纯;健康人血清样品,
由大连理工大学校医院提供。

2.2 三种不同SERS基底的制备及样品检测
2.2.1 毛细管-AgNPs的SERS基底的制备及样品检测
实验中采用了传统的水浴加热法制备银纳米粒子。

实验过程中,主要研究了通过控
制反应温度来控制生成银纳米粒子的大小,并通过离心清洗分离的方法,得到分散较
为均一的AgNPs。

(1)水浴加热法制备纳米银胶:
1)30 mg硝酸银溶于150 mL去离子水中,放在磁力搅拌器上搅拌30 min,静置待用;
2)100 mg柠檬酸三钠溶于10 mL去离子水中,放在磁力搅拌器上搅拌30 min,静
置待用;
3)将硝酸银溶液放在水浴锅中加热至所需温度(对比实验中,分别为
89 ℃,91 ℃,93 ℃,96 ℃,98 ℃);逐滴加入柠檬酸三钠溶液4 mL,同时剧烈搅拌,继续加热,保持此温度60 min,使硝酸银与柠檬酸三钠充分反应;
4)反应后的溶胶冷却至室温待用。

(2)罗丹明6G的拉曼光谱检测
将制备的银胶用离心方法(8000 r/min,10 min),清洗三次之后,与R6G(10-6M/L)按照1∶1混合,震荡1 h,吸入毛细管中,激光功率100%,进行拉曼光谱的检测,实验结
果如图1所示。

通过上图可以看出,93 ℃条件下制备的银纳米粒子的增强效果最佳。

(3)利用毛细管-AgNPs的SERS基底对健康人血清进行测试
为了找到银胶与血清合适的配比,得到灵敏度更高的SERS光谱,做了以下对比实验:分别将血清与银胶按照1∶0,2∶1,1∶1,1∶2,1∶3,0∶1的比例混合,震荡1 h,待其
充分混合后,吸入毛细管中,测其拉曼光谱,如图2所示。

从图2中可以看出,未加入银胶的纯血清样品基本上检测不到明显的拉曼谱峰;血清与银胶按照2∶1比例混合之后,可以测出血清的拉曼光谱,但是血清的拉曼光谱灵
敏度不高;当血清与银胶比例为1∶1时,可以较好地测出血清的拉曼光谱;继续增加
银胶的量,血清与银胶的比例分别为1∶2,1∶3时,在所测得拉曼光谱中,银胶的背景干扰峰强度逐渐增强。

综上分析,我们选择血清与银胶按照1∶1比例混合,进行下
一步实验。

将制备的93 ℃纳米银胶,经过离心清洗之后,与健康人血清样品(25号)按照1∶1混合,震荡1 h,吸入毛细管中,激光功率100%,测其拉曼光谱,如图3所示。

2.2.2 二氧化钛-AgNPs的SERS基底的制备及样品检测
(1)TiO2-AgNPs基底的制备
第一步:制备TiO2薄膜:
1)50 mL钛酸丁酯和3 mL乙酰丙酮混合在一起,搅拌10 min,形成溶液A;
2)110 mL酒精,1.4 mL去离子水,0.2 mL硝酸混合在一起,搅拌10 min,形成溶液B;
3)在搅拌过程中,溶液B逐滴加入溶液A中,混合溶液搅拌30 min,形成TiO2溶胶。

TiO2薄膜通过浸渍的方法沉积在玻璃基板上,TiO2薄膜厚度通过调整镀膜提拉机
的提拉速度来控制(对比实验中,提拉速度的设置:1-7号分别为20 mm/min,50
mm/min,100 mm/min,150 mm/min,200 mm/min,250 mm/min,300
mm/min)。

最后,样品在450 ℃的温度下,煅烧1 h,形成TiO2薄膜。

第二步:TiO2薄膜上生长AgNPs:
将覆盖有TiO2薄膜的玻璃基板放在3 mM/L的AgNO3溶液中,用紫外灯照射,催化沉积AgNPs。

基板与紫外灯距离6 cm,照射时间为60 min。

(2)罗丹明6G的拉曼光谱检测
将上面制备好的基底浸泡在R6G(10-6M/L)中1 h,得到TiO2+AgNPs+R6G样品,激光功率为50%,测其拉曼光谱,如图4所示。

通过以上所测得R6G的拉曼光谱可知:随着提拉速度由20 mm/min增加到300 mm/min,所形成的TiO2薄膜逐渐增厚;并且在紫外灯光照还原AgNPs60 min后,拉曼光谱的相对强度也有逐渐增加的趋势。

但是当膜的厚度达到一定值时,再继续增加膜的厚度,拉曼光谱相对强度反而减弱。

此外,从基底制备过程中,我们可以发现,随着提拉速度增加,膜的厚度在增加,膜的断裂情况越严重。

所以综合考虑,选取5号基底(提拉速度为200 mm/min),进行进一步的实验。

(3)利用TiO2-AgNPs的SERS基底对健康人血清进行测试
将健康人血清样品(25号)滴到基板上,激光功率50%,测其拉曼光谱,如图5所示。

2.2.3 滤纸-AgNPs的SERS基底的制备及样品检测
(1)滤纸上银纳米粒子的SERS基底制备:
1)纳米银胶的制备:本实验采用微波法制备纳米银胶,具体方法如下:
a.30 mg的AgNO3溶于150 mL的去离子水中,放入微波炉中加热3 min(中高档,W=595 w);
b.取出后,放在磁力搅拌器上快速搅拌,同时缓慢滴入柠檬酸三钠溶液(质量百分比为1%,总计4 mL);
c.再次将混合溶液放入微波炉中,加热5 min,然后取出放在磁力搅拌器上搅拌,待冷却到室温。

将制备的银胶离心清洗之后,浓缩10倍。

2)滤纸SERS基底制备:将层析滤纸剪成1 cm×1 cm的尺寸,为作对比实验,准备以下4种样品:
a.将剪好的滤纸放入浓缩的银胶中浸泡1 h,取出后用去离子水冲洗;
b.直接用移液器移取适当浓缩的银胶滴到滤纸上;
c.将剪好的滤纸放入未浓缩的银胶中浸泡1 h,取出后用去离子水冲洗;
d.直接用移液器移取适当未浓缩的银胶滴到滤纸上。

(2)罗丹明6G的拉曼光谱检测
将以上四种不同条件下制备的滤纸-AgNPs基底浸泡在R6G(10-6M/L)中10 min,得到滤纸+AgNPs+R6G样品,激光功率为50%,测其拉曼光谱,如图6所示。

通过以上的对比实验,我们可以看出:实验中采用纳米银胶浓缩之后滴入到滤纸上所制备的SERS基底增强效果比较好,因此,选择该条件下制备的滤纸-AgNPs基底进行下一步实验。

(3)利用滤纸-AgNPs的SERS基底对健康人血清进行测试
移取10 μL健康人血清样品(25号)滴到滤纸-AgNPs基底上,激光功率50%,测其拉曼光谱,如图7所示。

(1)三种SERS基底SERSp强度的比较
为了便于分析比较,将三种不同的SERS基底对同一个健康人血清检测的拉曼光谱(激光功率分别为:毛细管-AgNPs为100%,TiO2-AgNPs为50%,滤纸-AgNPs为50%),各自求出平均谱后(该处的平均谱为三种SERS基底对同一健康人检测的拉曼光谱,各自取得平均谱(每种基底分别检测10个左右测试点,所获得数据取平均值),在同一坐标系下表示出来,这样做的目的是为了便于比较三种SERS基底的性能),在同一坐标系下表示出来,如图8所示。

为了能够较好地分析实验数据,需要对原始的实验数据进行一定的预处理,扣除其荧光背景。

对三种不同SERS基底所采集的血清样品的平均拉曼光谱进行10次多项
式拟合[19],拟合结果如图9所示。

三种不同基底SERSp的强度不同说明三种SERS基底的拉曼增强效果不同,即SERS基底灵敏度不同。

由图9所示,TiO2-AgNPs基底所测得的血清拉曼光谱的强度最高(C),滤纸-AgNPs 基底次之(B),而毛细管-AgNPs基底(A)最低。

三种SERSp谱峰的强度比等于三种SERS基底的灵敏度之比。

考虑到激光功率的不同,并且近似认为拉曼强度与激光功率的平方成正比,以725 cm-1谱峰为比较标准,设A(毛细管-AgNPs)=1,则A(毛细管-AgNPs基底):B(滤纸-AgNPs基底):C(TiO2-AgNPs基底)≈ 1∶18∶30。

上述
比较数字说明,TiO2-AgNPs基底的灵敏度最好,其次为滤纸-AgNPs基底,此二者的灵敏度比毛细管-AgNPs基底的灵敏度分别高30倍和18倍。

分析前二者与第三
者灵敏度的不同,可能原因有二:其一、在前二者基底上的血清样品中水份已经蒸发、呈凝胶状态,使检测样品有一定程度的富集,提高了检测样品的浓度;而第三者基底中的血清样品仍是原始液态,样品没有浓缩;其二、前二者基底上的银粒子的聚集明显
比第三者紧密,从而“热点”的密度和增强效果后者不如前二者。

(2)三种SERS基底相对SERSp强度的比较
选定725 cm-1处的谱峰高度作为内标,来比较它们三者的相对SERSp强度,讨论用三种不同的SERS基底,检测同一血清样品,其相对的SERSp强度是否相同。

相对的SERSp可以给探讨生物大分子的化学键及官能团相对变化提供条件[20]。

相对的
表面增强拉曼光谱(相对SERSp)公式为:I / I725,I表示相对SERSp特征峰的强度,
三种基底检测健康人血清的SERSp的几个主要特征峰的初步归属与指认及相对强度I / I725,如表1。

注:υ:伸缩振动;γ:平面外变形;δ:弯曲振动
通过以上分析可知:三种不同基底所测得同一健康人血清的拉曼光谱几个主要的谱
峰基本一致,而且已经找到相应的谱峰归属。

选定725 cm-1特征峰作为内标,三种拉曼增强基底检测到的相对的SERSp的谱峰强度与三者平均值之间的方均根差分
别为:毛细管-AgNPs为3.2%,滤纸-AgNPs为4.2%,TiO2-AgNPs为4.8%,即为4.0%±0.8%之间,相当好,说明三种拉曼增强基底检测到的相对的SERSp基本上是相符的,在4.0%±0.8%的误差范围内是一致的,证实三种基底的可靠性和实用性。

(3)三种SERS基底制备过程比较
毛细管-AgNPs基底的制备过程,首先通过水浴加热方法制备纳米银胶,离心清洗,然后直接吸入毛细管中即可;TiO2-AgNPs基底的制备需要先制备TiO2溶胶,然后通过提拉法将溶胶沉积在玻璃基板上,接下来高温煅烧1小时,形成TiO2薄膜,最后通过紫外灯照射,用还原法在上面生长AgNPs,形成TiO2-AgNPs基底;滤纸-AgNPs 基底的制备过程,首先用微波法制备纳米银胶,然后离心清洗,浓缩之后,直接滴到层析滤纸上即可。

所以,从制备过程来看,毛细管-AgNPs基底和滤纸-AgNPs基底的制备较为简单,而TiO2-AgNPs基底的制备过程相对来说较为复杂。

本文首先将三种不同的基于AgNPs的SERS基底对浓度为10-6M/L的R6G分子进行拉曼光谱检测,并对结果进行比较,分别找出三种基底最佳制备条件。

最后将最佳条件下制备的三种基底分别应用到同一健康人血清的检测中,并对所测拉曼光谱进行分析比较,初步可得出以下结论:TiO2-AgNPs基底的灵敏度最好,其次为滤纸-AgNPs基底,此二者的灵敏度比毛细管-AgNPs基底的灵敏度分别高30倍和18倍;三种基底在误差范围内都是可靠的和实用的;TiO2-AgNPs基底制备过程较为复杂一些,而毛细管-AgNPs基底及滤纸-AgNPs基底的制备较为简单。

综合考虑,滤纸-AgNPs基底由于其制作过程简单易行,灵敏度也比较高,比较适合血清的表面增强拉曼光谱检测;如果期望有更高一点的灵敏度,可选TiO2-AgNPs基底。

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