凝集素芯片对标记糖蛋白的定量

凝集素芯片对标记糖蛋白的定量
陈培1，康晓楠2，孙淳2，刘银坤3
（1. 复旦大学附属中山医院肝外科，上海200032；
5 10 15 20 25 30 35 40
2. 复旦大学生物医学研究院，上海，200032；
3 复旦大学附属中山医院肝癌研究所，上海200032）
摘要：目的进一步研究凝集素芯片对标记糖蛋白中定量的可行性. 方法凝集素芯片是结合
生物芯片技术和凝集素特性建立的检测糖蛋白糖链结构的糖组学新的重要研究工具。

结果
包被在基片上的凝集素与糖蛋白特异性亲和,荧光标记糖蛋白浓度与荧光信号值存在线性关
系,1mg/ml 是合适的凝集素点样浓度,凝集素芯片结合荧光探针技术非常敏感。

结论凝胶基
片适合用来点制凝集素芯片，凝集素芯片可以精确定性和定量糖蛋白。

关键词：分子生物学；凝集素；生物芯片；糖蛋白
中图分类号：Q71
Lectin microarray used in the quantification of labeled
glycoproteins
CHEN Pei1, KANG Xiaonan2, SUN Chun2, LIU Yinkun3
(1. Zhongshan hospital,Fudan university,Shanghai 200032;
2. Institute of Biomedical Science,Fudan University,Shanghai,200032;
3. Liver cancer Institute,Zhongshan hospital,Fudan university,Shanghai 200032)
Abstract: Objective Further study of the feasibility of lectin microarray 's application in the quantification of labeled glycoproteins. Methods Integrated with the characteristics of lectin and fluorescence technique. Results Lectin microarray allows sensitive observation of multiple
lectin-glycan interactions. 1mg/ml maybe the suitable lectin spotting concentration. It is feasible to analyze glycans structure of glycoproteins with the lectin microarray. Gel-slide is the suitable
choice for the fabrication of lectin microarray. There is a linear relationship between the glycoprotein concentration and the fluorescence signal value. The lectin microarray is very sensitive. Conclution Lectin microarray can be used in the quantification of labeled glycoproteins.
Key words: Molecular Biology;Lectins;Microarray Analysis;Glycoproteins
0引言
现代生物医学认为，糖链是继核酸和蛋白质之后的第三类包含生物信息、具有遗传性的
生物大分子。

然而蛋白质糖部分的多源性和复杂性阻碍了研究。

糖链的结构复杂且变化巨大，目前一些糖链分析的技术，如质谱仪、western blotting和层析，由于相当复杂[1,2]在应用上有
一定局限性。

因此需要发展一种准确、简便、高通量的方法来检测糖蛋白的糖链结构[3]。

凝集素芯片就是以不同凝集素和糖蛋白糖链特异性亲和合为原理的，利用荧光标记和
自动荧光扫描技术记录检测分析的一种准确、简便、高通量检测糖蛋白糖链结构的生物芯
片技术[4,5]。

我们选择了凝胶基片，将糖蛋白进行荧光标记，亲和后凝集素点的信号强度随糖蛋白的
浓度增加而增加。

我们选择了一对典型的特异性亲和的凝集素RCA-I和糖蛋白ASF，来测试
基金项目：教育部博士点新教师基金(编号200802461155)
作者简介：陈培1970 年出生，男，主治医师，肝肿瘤糖组学
通信联系人：刘银坤（1944 出生），男，教授，肝肿瘤糖蛋白质组学.E-mail:*************************.cn
凝集素芯片对糖蛋白的定量。

1材料与方法
1.1.材料
45 50 55 60 65 70 75
蓖麻子凝集素（Ricinus Communis Agglutinin I ，RCA-I）（Vector，美国）；去唾液酸
胎球蛋白（Asialofetuin, ASF）from fetal calf serum Type I（Sigma，美国）；Cy3 Mono-reactive Dye Pack.（GE healthcare，美国）；晶芯十二孔围栏高分子三维凝胶基片( Capitalbio中国)；Econo-Column 层析柱, 1.0×20cm，(Bio-Rad，美国)；Sephadex G-50，渗透凝胶（Sigma，
美国）；0.1M 碳酸钠缓冲液（PH9.3）、1×PBS 缓冲液（PH7.0）、1×TBS 缓冲液（PH7.6）；晶芯蛋白生物芯片点样液( Capitalbio中国)；Smart Arrayer－48 生物芯片点样仪，LuxScan
10K－A生物芯片扫描仪。

1.2方法
1.2.1 Cy3-AS F的制备和分离按试剂盒说明书。

1.2.2芯片的制作
我们将凝集素RCA-I 以0.1, 1, 2 mg/ml 溶解于晶芯蛋白点样液。

然后使用Smart Arrayer －48 点样仪，将凝集素分别点样至晶芯十二孔围栏高分子三维凝胶基片。

从左上到右下，
凝集素浓度从空白、0.1mg/ml、1mg/ml、2mg/ml 依次增加，点的直径为150um，点间距为400um，每个点重复三遍，点样后芯片抽真空25℃过夜以固定凝集素。

1.2.3封闭
每孔围栏内加入50µl 2％BSA-TBS 溶液，25°C 摇晃 1 小时封闭后，将芯片以
0.1%TBS-Tween20 溶液清洗两次，每次5 分钟，清洗后甩干。

1.2.4杂交
将Cy3-ASF 的Cy3 浓度用1×TBS 溶液调整为0.01、0.1、1、10、100、1000nmol/l，每个围栏内加30 µl Cy3-ASF 溶液，从上至下浓度递增，于30°C、湿盒、避光、摇床上孵育 2 小时，然后0.1%TBS-Tween20 溶液清洗 3 次，15 分钟后甩干。

1.2.5扫描和信号分析
使用LuxScan 10K－A扫描芯片，使用LuxScan 3.0 软件分析得出芯片荧光信号数据。

使用Excel 2000 软件处理得到均值，标准差和变异系数。

2结果
2.1凝集素芯片的信号重复性的测定
实验重复四遍，当凝集素点样浓度为1mg/ml 时，信号的变异度在10％以内（表1）。

2.2凝集素最佳点样浓度
固定糖蛋白Cy3 浓度时，不同浓度凝集素点样的荧光信号变化曲线形态相似，1mg/ml
和2mg/ml 点样浓度的两条荧光值曲线几乎重合（图2）。

而且1mg/ml 时的荧光信号的变异度最低。

Cy3-ASF 的D/P＝8.35。

2.3糖蛋白与凝集素结合定量实验结果
下面两图点样方式为两行六列，三点一组，左上至右下各组凝集素浓度为空白、0.1、1、
2 mg/ml, 杂交的荧光标记糖蛋白溶液从上至下按Cy
3 浓度0.01、0.1、1、10、100、1000nmol/l
递增。

80
图 1 RCA-I 和Cy3-ASF 结合荧光图象
表1 RCA I和Cy3-ASF不同结合条件下的荧光值
不同Cy3 浓度荧光标记糖蛋白的凝集素点荧光值u
凝集素点样0.01nM 0.1nM 1nM 10nM 100nM 1000nM 浓度
空白0.1mg/ml 1mg/ml 2mg/ml
14±1
502±23
3658±333
4029±345
7±3
596±31
4509±196
4689±553
7±1
643±60
4798±4
5389±39
11±0
896±139
7508±441
8307±479
16±12
2135±215
16772±1350
18817±1585
107±36
3662±188
27498±794
30677±3267
85
凝集素点样浓度
表 2 RCA I&Cy3-ASF 结合信号的变异系数 CV
CV
0.1mg/ml 1mg/ml 2mg/ml
5% 9% 9%
5% 4% 12%
9% 0% 1%
15% 6% 6%
10% 8% 8%
5% 3% 11%
图 2 RAC-I&Cy3-ASF 结合信号荧光值线图
90
选择 1mg/ml 点样浓度 RCA-I 不同浓度 Cy3-ASF 结合荧光值曲线，取 10nM －1000nM 区间得出 Cy3 浓度和 Cy3-ASF 荧光值的线性回归方程式如(图 3)
图 3 1mg/ml RCA-I 点样浓度时 Cy3 浓度和荧光值线性回归方程式（10－1000nM ）。

95
100
3 小 结
我们选择了一对有代表性的凝集素和糖蛋白(RCA-I 和 ASF)来验证凝集素芯片对糖蛋白 的定量检测。

结果显示凝集素与凝胶基片的结合相当牢固，而且不影响其与糖蛋白亲和的活 性，凝集素和相应糖蛋白的亲和也相当牢固。

实验提示，凝集素芯片不仅可以定性糖蛋白而 且可以定量糖蛋白的浓度。

凝集素芯片非常敏感，在 RCA-I 点甚至可以测得低于 1 pg 的
ASF 。

.
在固定糖蛋白Cy3 浓度的条件下，选择不同浓度凝集素点样，结果发现RCA-I 和
Cy3-ASF 的结合曲线图上，高于1mg/ml 的两条荧光信号曲线形状几乎吻合。

随着凝集素点样浓度增加，荧光信号值没有明显的增长，而且1mg/ml 点样浓度时的荧光信号值变异系数最低，因此我们认为1mg/ml 在该固定实验条件下是比较合适的凝集素点样浓度。

105 110
115 120 125
结果显示在一定的区间内，糖蛋白的浓度与荧光信号值成线性回归关系。

选择1mg/ml 浓度的曲线，我们作出线性回归方程（图4）,根据线性回归方程式我们可以计算出不同荧光值下的糖蛋白的浓度。

实验的结果显示了凝集素芯片不仅可以定性检测糖蛋白，在使用自动化点样仪和合适的点样缓冲液时，凝集素芯片还可以用来定量糖蛋白。

这种方法的最大优点是可以同时检测多个样本，具有批量化、标准化和自动化的特点。

这些结果强烈提示这种凝集素芯片足以进行凝集素-糖链反应的比较分析。

通过选择、增加凝集素的种类，我们可以合成更加完善的凝
集素芯片应用于生物医学领域包括肿瘤相关的糖组学研究[6]。

[参考文献] (References)
[1] Pilobello, K T, Krishnamoorthy, L, Slawek, D, Mahal, L K, Development of a lectin microarray for the rapid analysis of protein glycopatterns[J].Chem. Bio. Chem.,2005, 6,:985-989.
[2] Kuno, A., Uchiyama, N., Koseki-Kuno, S., Ebe, Y. et al., Evanescent-field fluorescence-assisted lectin microarray: a new strategy for glycan profiling[J]. Nature Methods 2005, 2(11): 851-856.
[3] Ratner, D M, Adams, E W, Su, J, et al., Probing Protein - Carbohydrate Interactions with Microarrays of Synthetic Oligosaccharides. Chem. Bio. Chem., 2004, 5:379-383.
[4] Angeloni, S, Ridet, J L, Kusy, N, Gao, H,et al., Glycoprofiling with micro-arrays of glycoconjugates and lectins[J]. Glycobiology,2005, 15: 31-41.
[5] Schena, M.. Microarray analysis[M]. Newyork:Jhon Wiley &Sons Inc., 2003.
[6] Ratner, D. M., Adams, E. W., Diney, M. D. et al.. Tools for glycomics: mapping interactions of carbohydrates in biological systems[J]. Chem. Bio. Chem., 20O4, 5:l375-1383.。