离子交换色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白的质量浓度

第50卷第3期辽 宁化工V〇1.50, No. 3 2021 年 3 月_________________________________Liaoning Chemical Industry__________March,2021分析检硎
离子交换色谱法测定牛初乳中
乳铁蛋白的质量浓度
刘佳欣，贺梦瑶，汤兴楠，栾凯雯
(沈阳化工大学制药与生物工程学院.辽宁沈阳110142〉
摘要：建立一种离子交换色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白质量浓度的方法。

采用cm-sepharose fast
f l o w预装柱5 m L,配置质量浓度为10、20、30、40、50、60、70、S O i x g.m L—1的标准乳铁蛋白溶进行
液色谱分离，p H值为7.0,浓度为0.02 mol C的磷酸盐溶液为起始缓冲液，进样量为1m L,流速1
m L'm i i f1,浓度为 1 m o l‘L_lN a C l溶液洗脱，检测波长475m n。

回归方程：y=1.2774x+16.727 0,/?2=0.999,
线性范围为1〇~80i x g'm L'平均加标回收率为96.56%。

此方法在分离牛初乳中的乳铁蛋白同时，又
可以测定乳铁蛋白的含量，方便，快捷，结果准确可靠，重现性好。

关键词：离子交换；牛初乳；乳铁蛋白；检测
中图分类号：T Q0658.6飞文献标识码：A文章编号：1004-0935 (2020) 03-0419-04
乳铁蛋白（Lactoferrin,L F)是一种相对分子量 约为80 k D a的铁结合性糖蛋白，主要存于哺乳动物 的乳汁中m，经研究发现也出现在人和哺乳动物的
胰液、胆汁和小肠分泌液等组织[21。

乳铁蛋白在乳 中的含量最为丰富，特别是在初乳中含量较高，人 初乳中乳铁蛋白的浓度可达到7 n^m L'牛初乳中 乳铁蛋白的浓度平均为1n^m L_U31。

乳铁蛋白具有 多种生物学功能，可以促进铁的吸收[41’抗癌，抗病毒，抗氧化，调节机体免疫反应|MI。

乳铁蛋白还具有抑 制脂质过氧化、抑制胆固醇的积累，促进骨骼生长 的功能|8_91，还可以同多种抗生素和抗病毒药物协同 作用tltMI1。

目前检测乳铁蛋白的方法有很多种，如高效液 相色谱法(1'酶联免疫法|131,聚丙烯酰胺凝胶电泳 法毛细管电泳法"51等。

高效液相色谱法的优点 是快速，准确，稳定可靠，精密度高，但该方法对 样品的纯度要求比较严格，仅适用于高纯度的样品 测定酶联免疫法的基本原理是抗原抗体的特异性反应，样品中的其他蛋白质并不与乳铁蛋白的抗 体发生反应，因此该法对样品纯度要求较低，不需 要进行纯化，但是该方法操作时需要对待测样品进 行逐级稀释，过程繁琐，容易出现误差|171。

毛细管 电泳法具有分析速度快、分离效率高、操作简便、操作成本低等优点，但该方法仅适用于保健食品、婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白的测定，对生乳中乳铁 蛋白含量的测定效果不佳％。

聚丙烯酰胺凝胶电泳法具有设备简单、费用低、操作方法简单等优点，但检测时间长、不宜检测大批量样品、检测过程较 为复杂等"91。

本试验试验采用离子交换色谱法测定 牛初乳中乳铁蛋白含量，操作方便，准确可靠，并 且分离和检测可以同时进行，大大提高试验效率。

1材料与方法
1.1材料与试剂
95%乳铁蛋白，biotopped公司；牛初乳，木兰 花乳业奶牛养殖场；cm-sepharose fast flow 5 m L,通用电气公司；盐酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠均 为分析纯，西陇化工股份有限公司。

1.2仪器与设备
A K T A purifier,通用电气公司；高速冷冻离心 机，赛默飞世尔科技有限公司；Synergy2多功能酶 标仪，美国伯腾仪器有限公司；H H4型数显恒温水 浴锅，金坛市天瑞仪器有限公司；G B1302型电子 精密天平，梅特勒托利多仪器公司，S H Z-D (HI)循 环水式真空泵，巩义市予华仪器责任公司。

1.3试验方法
1.3.1样品预处理
将牛初乳装入100 m L离心管中，以10 〇〇〇r-m i r T'4 t离心30 m i n,除去上层月旨肪；力口入1m o l_L_l的稀盐酸，缓慢添加调至牛初乳溶液p H为 4.6,水浴加热40 T，保温30 m i n,然后放人高速 冷冻离心机中，以10 000 r m i n140 t离心30 m i n,
收稿日期：2020-10-21
作者简介：刘佳欣（1995-),女，辽宁省丹东市人，研究方向：乳铁蛋白的提取及分离纯化。

(x g -m L _ 〇
100
保留上层乳清蛋白，将得到乳清蛋白溶液；进行抽 滤，得到的粗样品，用0.45^1的微孔滤膜过滤， 得到纯净的样品。

1.3.2标准乳铁蛋白溶液的配置
精确称取纯度为95%的乳铁蛋白标准品0.01 g , 用0.15 m〇l L M N a C l 溶液定容至100 m
L
，配成质量
浓度为100 |x g _rnL _1标准乳铁蛋白溶液。

选用0.22
的微孔滤膜过滤，用于色谱测定。

1.3.3最大吸收波长的确定
将上述配置好的100 g m L
1标准乳铁蛋白溶
液，用紫外分光光度计在400~700n m
下扫描，测定
最大吸收波长为475 n m 。

1.3.4色谱条件
色谱柱 cm-sepharose fast flow 预装柱 5 m L
;流
动相：A 溶液（P H 值为7.0浓度为0.02 r n o l.C 的憐
酸缓冲盐溶液）；B 溶液（p H
值为7.0浓度为 1
N a C l 混合溶液），流速
1 m L mirf 1,进样量:
1 m L ;检测器:紫外检测器；检测波长为475 n m 。

1.3.5穿透曲线的绘制
精确量取上述配置的标准乳铁蛋白溶液（100
(x g 'm L 1 ) 10 m L。

采用 superloop 10 m L 上样管进行
上样，按照1.3.4的色谱条件进行动态吸附，观察紫 外检测器变化，绘制穿透曲线。

1.3.6乳铁蛋白标准曲线绘制
取9只试管，分别加人0、1.0、2.0、3.0、4.0、 5.0、6.0、7.0、8.0 m L
的乳铁蛋白标准品溶液（质
量浓度为l O O p g m L 1 )用0.15 m o l _L _l N a C l 溶液补
足到10 m
L
，混合均匀，30 m i n 内以0管为空白对
照，以标准乳铁蛋白的质量浓度为横坐标，以乳铁 蛋白标准品在475 n
m
处的紫外吸收峰面积为纵坐
标，绘制标准曲线，并计算曲线方程。

2结果与讨论
2.1穿透曲线的绘制标准乳铁蛋白的在cm-sepharose fast f l o w 离子
交换色谱上的穿透曲线如图1。

试验在的流速1
m l v m i r T 1下进样，由图1可见上样体积达到1 m L
时
达到穿透点，2 m
L
左右cm-sepharose fast fla w 离子交
换色谱吸附基本达到饱和，之后吸附作用开始减弱， 由此计算得到，进样2 m
L
左右可以使预装柱充分
吸附，当吸附达到饱和时，继续进样不仅对吸附量的 增加效果不大，而且由于溶质浓度急剧变大，还会 造成目标产物的损失，因此确定最大上样量为100
图 1 cm-sepharose fast flow 穿透曲线
2.2精密度试验
精确吸取100 i x g m r 1的乳铁蛋白标准标准溶 液6份，各5 m
L
,加人0.15 m o l ‘L 1 N a C l 补足到10
m L
于具塞试管中，按1.3.4中方法测定峰面积，计
算R S D
=1.039%。

（相对标准偏差R D S =% )
表1
精密度试验结果U =6 >
序号峰面积平均值
RSD/%
180.573281.657380.50380.997 1.039
479.607581.4936
81.726
2.3重复性试验
精确吸取样品溶液6份各5 m L ，加人0.15
mol l /1 N a C l 溶液补足到10 m L
于具塞试管中，按
1.3.4中测定峰面积，计算R S D =1.299%。

表2
重复性试验结果（《=6 )
序号峰面积平均值
RSD/%
1
55.065254.674354.23355.252 1.299
455.319556.0226
56.012
2.4稳定性试验
精确吸取丨00 (J L g m l /1的乳铁蛋白标准标准溶 液6份，各 5 m
L
,加入0.15 m o l t N a C l 补足到10
m L
于具塞试管中，分别在0.5、1、1.5、2、2.5、3、
3.5、4 h 按照 1.3.4中方法测定峰面积，计算
420
辽宁化工2020年3月
o
o
o
o
8
6
4
2
%/o /u
第50卷第3期刘佳欣，等：离子交换色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白的质量浓度421
10 20 30 40 50 60 70 80
乳铁蛋白质》浓度/(Kg •!•_')
图2乳铁蛋白标准曲线
2.7离子交换色谱起始缓冲液p H的选择
牛乳中乳铁蛋白的等电点约p H 7.8,缓冲液p H 值与蛋白质等电点相差越大，蛋内质所带正电荷越 多，与阳离子交换剂结合越牢固，大于等电点乳铁 蛋白会产生沉淀，产物不能出现离子化。

因此分别 选择p H 6、6.5、7、7.5、8的磷酸缓冲溶液，进行 动态吸附试验。

试验过程中对乳铁蛋白回收率的变 化情况进行监测，得到最佳起始缓冲液p H值。

试验研究过程中，在质量浓度相同p H值不同 的流动相条件下，对牛初乳中所含的乳铁蛋白和其 他蛋白质的分离程度进行了研究。

结果发现不同P H 值的流动相对样品的分离效果有一定的影响，并且 乳铁蛋白的出峰时间也有所不同。

当起始缓冲液的p H值髙于8.0 B寸，乳铁蛋白基 本无法吸附在cm-sephrosfi fast flow色谱柱上，乳铁 蛋白会与部分杂蛋白等组分一起率先被洗脱下来，这是因为起始缓冲液的p H值高于8.0时乳铁蛋白会 产生沉淀，产物不能出现离子化碳水化合|201。

当起始 缓冲液的p H值低于6.5时，乳铁蛋白的出峰时间明 显延后，这是由于乳铁蛋白自身所带的电荷增加以 及与离子交换柱之间的吸附能力增强所致。

采用p H值低于6.5的磷酸盐溶液作为起始缓冲 液，洗脱时需要高浓度的盐溶液才可以将乳铁蛋白 洗脱下来，由于盐溶液浓度过高易腐蚀泵头，并且 浪费试剂，不适合作为首选。

当初始缓冲液的p H值低于8时，乳铁蛋白是 带负电荷的，乳铁蛋白并不能与Cm-sepharose fast flow色谱柱交换电荷和吸附，因此乳铁蛋白和杂蛋 白一起被洗脱下来。

经过反复试验，发现起始缓冲 液的p H值为7时，乳铁蛋白出峰时间较早，并且 很好的与杂蛋白分离，可以获得了较高纯度的乳铁 蛋白。

2.8洗脱方式的选择
2.8.1梯度洗脱
采用0~1.5 m ol L'N a C l进行梯度洗脱，分离效 果不佳，峰形较为扩散，采用梯度洗脱时，洗脱剂梯度 变化的快慢和洗脱液浓度都会影响分离效果。

而且 梯度速率的变化控制也是比较困难的。

2.8.2分布洗脱
配置浓度为0.3、0.5、0.7 m o l‘1/1N a C l溶液依 次进行洗脱，这一步目的是先将杂蛋白与乳铁蛋白 分离，并将杂蛋白洗脱下来，然后直接采用1.0 mol L'的N a C l溶液作为第四个分步，快速洗脱乳 铁蛋白组分。

经过反复试验，采用0.3、0.5、0.7m o l I^ N a C l溶液进行洗脱，可以将杂蛋白和乳铁蛋白完全
R S D=1.028%o
表3稳定性试验结果U=6 >
序号峰面积平均值RSD/%
180.891
280.045
381.867 80.483 1.028
480.579
579.542
679.799
2.5加样回收试验
精确吸取样品溶液6份，各 5 m L,精确吸取100 A g m C的乳铁蛋白标准标准溶液6份，各5 m L，加人0_15 mo l_L1N a C l补足到20 m L于具塞试管中，按 1.3.4的色谱条件测定峰面积，计算平均加样回收率=96.56%。

表4加样回收试验结果U=6 )
序号峰面积平均值R SD/%平均回收率/%
1129.766
2131.504
3130.902 80.997 1.03996.557
4132.745
5132.234
6129.233
2.6乳铁蛋白标准曲线的绘制
以乳铁蛋白的质量浓度为横坐标，以乳铁蛋白 在475 m n处的紫外吸收峰面积为纵坐标(样品进样 量l m L),做乳铁蛋白的标准曲线（见图2),由此 计算出的回归方程为y=1.277知+16.727 0，R2 =0.999 〇
125-----------------------------------------------------------------
y=\.211 4j c+16.727 0 -
R'=0.999 5
422化工2020年3月
a____
分开，从而杂蛋白率先洗脱出来，直接采用1.0 m o l_L M N a C l的高浓度的盐溶液作为第四个分步，可以快速洗脱乳铁蛋白组分，得到较为纯净的乳铁 蛋白P1】。

2.8.3单一浓度洗脱
从 2.5.2分布洗脱过程中得出，直接采用1.0 mol_L1N a C l溶液进行洗脱可以快速地将乳铁蛋白 分离出来。

从出峰效果分析，与分步洗脱有很好的 一致性。

差别仅在于没有将杂蛋白没有分开，但这 一步对乳铁蛋白的分离并未造成影响。

单一浓度洗 脱操作方便，节省时间和试剂。

3结论
乳铁蛋白作为一种新兴功能性食品配料，具有 很高的营养价值，近年来乳铁蛋白的提取纯化工艺 条件和应用研究在不断地增多，它已被成功的应用 在酸奶、婴幼儿配方奶粉等产品中[22]。

试验采用离 子交换色谱法对牛初乳中的乳铁蛋白的含量进行了 测定，按照方法学要求对试验的线性范围、精密度、重现性以及加样回收率等参数进行了确定。

该方法 方便快捷，准确可靠，对牛初乳中的乳铁蛋白进行 了分离和检测，为下一步乳铁蛋白的纯化奠定了基 础。

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Determination of the Mass Concentration of Lactoferrin in Bovine
Colostrum by Ion Exchange Chromatography
L IU Jia-xin,H E M eng-yao,TANG X ing-nan,L U A N Kai-wen
(S h e n y a n g University of Chemi c a l Technology, S h e n y a n g Liaoning 110142, C h ina )
Abstract ：A n ion exchange chromatography m e t h o d w a s developed to determine the m a s s concentration of lactoferrin in bovine colostrum. U s ing cm-sepharose fast flow pre-loaded c o l u m n 5 m L,10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 jig m L'1standard lactoferrin solutions wer e chromatographically separated, with p H value of 7.0, 0.02 m o l L"1phosphate solution as the initial buffer, sample quantity 1 m L, flow rate 1 m L rnin'1, 1 m o l-L"1 N a C l solution as eluent, detection wavelength 475 n m. T h e regression equation w a s7 =1.277 4x+16.727 0, R2 =0.999, the linear range w a s 10-80 g m L'1, and the average spike recovery rate w a s 96.56%. This m e t h o d can not only isolate lactoferrin from bovine colostrum, but also determine the content of lactoferrin, a nd i t is convenient, fast, accurate a nd reproducible.
Key words: Ion exchange; Colostrum; Lactoferrin; Detection。