嗜热丝氨酸蛋白酶抑制剂pnserpin的克隆表达及抗炎活性研究

中文摘要
丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitors, serpins)广泛存在于动物、植物及微生物体内，是丝氨酸蛋白酶的天然抑制剂。

参与生物体内许多重要的生命过程，如凝血、补体激活、炎症反应、细胞迁移、细胞基质重建以及肿瘤抑制等。

目前对于serpins缺陷相关疾病主要采用增补疗法，而临床上应用的主要是人血浆纯化获得的蛋白制剂，其成本较高，不利于广泛应用。

自然界中微生物的多样性为人们开发新药提供了不竭源泉，而嗜热微生物及其来源的蛋白质具有较高的稳定性，可开发更有价值的生物活性物质。

本论文对嗜热微生物Pyrobaculum neutrophilum 来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂Pnserpin的理化性质及抗炎活性进行研究，以期为serpins缺陷和炎症相关疾病的治疗提供新的备选药物分子。

一、Pnserpin的表达、纯化及性质表征
将Pnserpin全长基因，克隆到pET-28a表达载体中，并转化大肠杆菌BL21诱导表达，利用镍亲和柱层析纯化获得高纯度Pnserpin蛋白。

以丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶为底物，测定Pnserpin基本动力学常数及其抑制酶活力的最适反应温度、pH和热稳定性等理化性质。

研究结果表明Pnserpin是具有高度热稳定性的丝氨酸蛋白酶抑制剂。

二、Pnserpin抗炎活性研究
通过二甲苯致小鼠耳肿胀的急性炎症模型和脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7的炎症细胞模型，研究了不同浓度Pnserpin 对小鼠的抗炎作用。

实验结果显示，Pnserpin对二甲苯引起的小鼠耳肿胀具有明显抑制作用；而对LPS诱导的RAW264.7细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α和NO 的表达也具有明显抑制作用。

这表明Pnserpin具有较好的抗炎活性，可进一步开发和应用。

关键词：
Pyrobaculum neutrophilum；Pnserpin；动力学；炎症
Abstract
Serine protease inhibitors (serpins) are native inhibitors of serine proteases, constituting a large protein family with members spread over animals, plants and microorganisms. They are natural inhibitors of serine proteases, involved in a variety of important life processes, such as coagulation, complement activation, inflammatory response, cell migration, cell matrix reconstruction and tumor suppression. At present, the serpins dysfunctional diseases are mainly treated by complementary therapies. The clinical application of serpins is mainly obtained by human plasma purification, which cost is very high, and is not conducive to the wide application. The diversity of microorganisms provides an inexhaustible motive force for the discovery of new drugs. Proteins derived from the thermophilic microorganisms and their origins are highly stable, and can be developed for more valuable bioactive substances. In this paper, the properties and bioactivity of the serine protease inhibitor from Pyrobaculum neutrophilum (Pnserpin) were studyed, to provide a new candidate drug molecule for the treatment of serpins and inflammation-related diseases.
1.Cloning, expression, purification and characterization of Pnserpin: The gene of Pnserpin was cloned into pET-28a expression vector and then transformed into Escherichia coli BL21 to induce the expression of the protein. The optimal expression conditions of Pnserpin were explored, and the protein was purified by nickel affinity column chromatography. Using serine protease and cysteine protease as substrate, the basic kinetic constants and the optimum reaction temperature, pH and thermal stability of Pnserpin were determined. Our results indicate that Pnserpin is a highly thermostable serine protease inhibitor.
2.The anti-inflammatory activity of Pnserpin: The anti-inflammatory effect of different concentrations of Pnserpin in vivo was studyed using xylene-induced mouse ear swelling. In order to study the anti-inflammatory activity of Pnserpin at the cellular level, we investigate the effect of Pnserpin on the expression of proinflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β and IL-6, using lipopolysaccharide (Lipopolysaccharide, LPS) stimulated mouse macrophage cell RAW264.7. The results showed that Pnserpin had a significant inhibitory effect on xylene-induced
mouse ear swelling, indicating that Pnserpin had anti-inflammatory activity in vivo; The results at cellular level showed that Pnserpin significantly inhibited the expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in LPS-induced RAW264.7 cells. These experimental results indicated that Pnserpin had anti-inflammatory activity at the cellular and animal levels and could be further developed and applied.
Key Words:
Pyrobaculum neutrophilum; Pnserpin; kinetics; inflammation
中英文缩写对照
缩略词 英文全称 中文全称
β-D-Thiogalactoside 异丙基硫代半乳糖苷IPTG Isopropyl
SI Stoichiometry of inhibition 化学计量常数
association rate constant一级反应速率常数Kobs Pseudo-first-order
constant 二级反应速率常数
rate
Kass Second-order-association
constant 米氏常数
Km Michaelis
Serpins Serine protease inhibitors 丝氨酸蛋白酶抑制剂
electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳
gel
SDS-PAGE polyacrylamide
acid 乙二胺四乙酸EDTA Ethylenediaminetetraacetic
CHT ɑ-Chymotrypsin ɑ-糜蛋白酶
Carlsberg 枯草杆菌蛋白酶SUC subtilisin
K 蛋白酶K
PRK Proteinase
TNF-αTumor necrosis factor 肿瘤坏死因子-α
IL Interleukin 白细胞介素
IL-6 Interleukin-6 白细胞介素-6
IL-1β Interleukin-1β白细胞介素-1β
oxide 一氧化氮
NO Nitric
buffer 磷酸盐缓冲液
PB Phosophate
LPS Lipopolysaccharide 脂多糖
DEX Dexamethasone 地塞米松
目录
第一章前言 (1)
1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类 (1)
1.1.1 经典类丝氨酸蛋白酶抑制剂 (1)
1.1.2 非经典类丝氨酸蛋白酶抑制剂 (2)
1.1.3 Serpin类抑制剂 (2)
1.2 Serpin类的结构与机制 (3)
1.3 嗜热微生物来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂 (4)
1.4 丝氨酸蛋白酶抑制剂与炎症 (4)
第二章 Pnserpin的表达、纯化与性质表征 (6)
2.1 实验材料与仪器 (6)
2.1.1 实验仪器 (6)
2.1.2 实验试剂 (7)
2.1.3 菌株及质粒 (7)
2.1.4 培养基 (8)
2.2 实验方法 (8)
2.2.1 Pnserpin基因序列分析 (8)
2.2.2 Pnserpin和PnCHT的克隆、表达和纯化 (8)
2.2.3 Pnserpin抑制动力学常数的测定 (9)
2.2.4 Pnserpin性质表征 (11)
2.2.5 Pnserpin与蛋白酶相互作用 (12)
2.3 实验结果 (12)
2.3.1 序列分析 (12)
2.3.2 Pnserpin和PnCHT的克隆、表达和纯化 (14)
2.3.3 Pnserpin基本动力学常数 (15)
2.3.4 Pnserpin的热稳定性和pH稳定性 (20)
2.3.5 Pnserpin与蛋白酶相互作用 (21)
第三章 Pnserpin的抗炎活性研究 (24)
3.1 实验材料与仪器 (24)
3.1.1 实验仪器 (24)
3.1.2 实验试剂 (24)
3.1.3 实验动物 (25)
3.2 实验方法 (25)
3.2.1 Pnserpin对小鼠急性炎症的作用 (25)
3.2.2 Pnserpin对小鼠RAW264.7细胞的作用 (26)
3.3 统计学处理 (27)
3.4 实验结果 (28)
3.4.1 Pnserpin对小鼠急性炎症的作用 (28)
3.4.2 Pnserpin对小鼠RAW264.7细胞的作用 (32)
第四章讨论 (35)
4.1 Pnserpin的克隆、表达、纯化、基本动力学参数测定和理化性质表征 (36)
4.2 Pnserpin的抗炎活性研究 (37)
第五章结论 (38)
参考文献 (39)
作者简介及科研成果 (43)
致谢 (44)
第一章前言
丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitors, serpins）是对丝氨酸蛋白水解酶有抑制活性的一类蛋白质，广泛存在于植物、动物和微生物体内，是自然界中种类最多，含量最为丰富的蛋白酶抑制剂。

由于丝氨酸蛋白酶抑制剂能通过与靶蛋白酶相互结合形成稳定的复合体，来防止生物体内丝氨酸蛋白酶的有害水解激活，因而它在一系列重要的生理、病理过程中：如凝血、纤溶、补体活化、感染反应、细胞迁移等发挥着关键性的调控作用。

丝氨酸蛋白酶抑制剂是生物体内免疫系统的重要组成部分，是维持机体内环境稳定的重要调控因子[1]。

1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类
目前根据作用机制的不同，丝氨酸蛋白酶抑制剂可以分为三类：经典类（canonical inhibitors）；非经典类（non-canonical inhibitors）和Serpin类[2]。

1.1.1 经典类丝氨酸蛋白酶抑制剂
经典类丝氨酸蛋白酶抑制剂是该抑制剂的主要类型，由14～200个氨基酸残基组成，分子量大约在3～21kDa。

该类抑制剂的作用机制是经典的结合环构象作用机制，抑制蛋白酶的作用片段称为蛋白酶结合环，这种经典类的丝氨酸蛋白酶抑制剂与酶的活性部位以非共价键方式结合形成类似酶-底物的米氏复合物[3]。

根据序列的同源性特别是活性中心位置以及半胱氨酸数目和二硫键所形成的架桥结构，经典类的丝氨酸蛋白酶抑制剂分为18个家族，其中以Bowman-Birk 型家族（BBI）、Kazal型家族、Kunitz型家族、PI和PII家族的研究较多[1]。

BBI是胰脏分泌的胰蛋白酶类抑制剂，这类抑制剂通常具有两个独立非重叠的活性位点，它们分别作用于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，该家族核心区域中有18个必须氨基酸残基[4]。

Kunitz家族分为低分子型和高分子型两种类型，其氨基酸数目从几十到几
百个，分子质量从几千到十几万道尔顿不等。

该家族分子的三维结构高度保守，且拥有一个较明显的疏水核心，即：拥有六个半胱氨酸残基，且可以形成3个二硫键。

这种结构使得Kunitz家族具有高的热稳定性和pH稳定性[5]。

Kunitz 型蛋白酶抑制剂分布广泛，在猪胰脏、人尿、海葵、蛇毒液、蜗牛、家蚕、烟草天蛾、麻蝇、天花粉、海芋、花生和太湖蓝藻等许多动植物中均有分布。

这些来自不同物种的蛋白酶抑制剂不但具有相似结构和功能，且一级结构具有一定的同源性。

Kazal家族比较保守，一般由一个或多个Kazal结构域组成，在昆虫、鸟蛋、小龙虾、哺乳动物组织（如精液泡、胰腺和下领下腺）和体液（如血液，唾液）中均有分布。

目前已经发现100多种Kazal型蛋白酶抑制剂，其结构域均具有高度保守的序列结构和三维构象[6]。

PI和PII家族是一类创伤诱导型表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂。

PI家族只有一个活性中心，主要抑制糜蛋白酶，例如马铃薯蛋白酶抑制剂I（potato protease inhibitorI，PI-I）就具有一个活性中心。

P II家族有两个活性中心，可同时抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶，这种情况存在于马铃薯蛋白酶抑制剂II（potato protease inhibitorII，PI-II）和番茄蛋白酶抑制剂II（tomato proease inhibitorII，TI-II）中[7]。

1.1.2 非经典类丝氨酸蛋白酶抑制剂
非经典类丝氨酸蛋白酶抑制剂只存在于吸血性生物体内，它有两个作用区域，即N-末端残基区和C-末端残基区。

存在于水蛭素（hirudin）、扁虱抗血凝肽（tick anticoagulant peptide，TAP）和钝缘蟀素（ornithodorin）中，分子量在6～8kDa左右。

该类抑制剂只对凝血因子或凝血酶具有极强的抑制作用[8]。

1.1.3 Serpin类抑制剂
Serpin类抑制剂是具有丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域的丝氨酸蛋白酶抑制剂。

本实验所研究的来源于Pyrobaculum neutrophilum的Pnserpin属于Serpin 类抑制剂。

根据抑制活性不同，Serpin类抑制剂分为胰凝乳蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂和凝血酶抑制剂等种类。

Serpin类抑制剂可通过调节一系列丝氨酸蛋白酶的活性而参与例如纤溶、炎症反应、细胞迁移、细胞分化和凋亡等基本生命过程[2]。

1.2 Serpin类的结构与机制
Serpin类丝氨酸蛋白酶抑制剂是目前分布最广泛、成员最多的丝氨酸蛋白酶抑制剂，它们可抑制丝氨酸蛋白酶活力。

研究表明Serpin类丝氨酸蛋白酶抑制剂是自杀式抑制剂，可通过构象变化来抑制蛋白酶活力[8]（图1）。

图1 Serpins抑制蛋白酶机制
典型的serpin类丝氨酸蛋白酶抑制剂通常具有350-500个氨基酸，一般serpins的结构一般由3个β片层（A，B，C）和8-9个α螺旋（hA-hZ）以及催化中心RCL（reactive centre loop）组成。

在RCL上有蛋白酶切割的位点，其被酶切后RCL的N端部分插入到β片层A的中间，形成一个额外的β股（S4A），从而使与RCL相连的目标蛋白酶被翻转到serpins分子的另一侧。

在形成的serpins-protease复合物中，目标蛋白酶可与serpins结合，使蛋白酶的活性部位产生部分解折叠，导致构象变化使酶催化中心发生扭曲，从而阻止了酶的进一步水解以及释放。

serpins的这种构象变化过程叫做“stressed（S）to relaxed（R）transition”[9]。

Serpins的特殊抑制机制要求它的结构有很大的柔性才能发生构象翻转，而蛋白质分子结构的柔性对应的是不稳定性，尤其是对热不稳定。

serpins的亚稳态构象一方面为它的抑制功能提供动力，另一方面也使它具有不稳定性。

如：人的α1-抗胰蛋白酶在体内环境发生微小变化时（pH改变或者体温升高），就会发生错误折叠或者形成聚体，导致功能缺陷进而引发肺气肿和肝硬化等多种
疾病[3]。

1.3 嗜热微生物来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂
近年来，在嗜热菌中也发现了丝氨酸蛋白酶抑制剂。

这些丝氨酸蛋白酶抑制剂，即使在高温条件下仍具有抑制活性。

嗜热微生物（Thermophiles）俗称高温菌或嗜热菌，是指最低生长温度45℃左右，最高生长温度在70℃或70℃以上的一群微生物[10]。

但到目前为止，只有极少数嗜热菌的丝氨酸蛋白酶抑制剂被解析表征，其中包括来源于中度嗜热细菌Thermobifida fusca的thermopin（最适生长温度为55℃），来自嗜热细菌Thermoanaerobactor tengcondensis的tengpin（最适生长温度为75℃），来自超嗜热古细菌Thermococcus kodakaraensis的tk-serpin（最适生长温度为90℃）和来源于超嗜热古细菌Pyrobaculum aerophilum（最佳生长温度超过100℃）的aeropin[11]。

Thermopin的C末端尾在其折叠和功能中发挥重要作用；tengpin的N-末端氨基酸形成的疏水片层是其构象变化所必需。

关于嗜热丝氨酸蛋白酶的其他结构与功能研究表明[12]，多重盐桥、氢键、疏水和阳离子相互作用在高温条件下保持其结构的稳定和抑制蛋白酶的活性中发挥重要作用。

目前，仍然有许多存在于极端亲本基因组中的丝氨酸蛋白酶抑制剂没有表征，它们的结构、功能和具体抑制机制亟待研究。

1.4 丝氨酸蛋白酶抑制剂与炎症
炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的反应，包括致炎因子引起的损伤、机体防御性反应和组织损伤恢复三个方面[13]。

轻微炎症反应对机体是有益的，属于免疫系统的一种防御反应；而过度炎症反应则对人体有很大危害，可影响免疫系统功能，引起自身免疫性疾病，如：系统性红斑狼疮等。

细胞因子是一个庞大的体系，其主要是由免疫细胞（巨噬细胞、T细胞和B细胞等）或某些非免疫细胞（内皮细胞和表皮细胞等）受到外界刺激而合成并分泌的一类小分子蛋白质，具有结合相应受体并调节细胞生长、分化和调控免疫应答的作用。

细胞因子常与靶细胞表面的特定受体结合，充当细胞间信息传递的信使，在免疫调节、免疫应答和炎症反应过程中起重要作用[14]。

细胞因
子由多肽和糖构成，分子量通常小于60kD，细胞因子之间可具有相近或相同的生物活性，能相互调节、相互叠加、相互协同或相互拮抗，表现出复杂的网络性[15]。

目前，已知参与炎症反应的细胞因子主要有白细胞介素（interleukin，ILs）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNFs）、干扰素（interferon，IFNs）和转化生长因子（transforming growth factor，TGF）等[16]。

在炎症的整个过程中，以上这些细胞因子表达异常。

研究表明[11]，细胞因子具有高效性特点，其微量浓度就可以发挥很强的生理效应。

一种细胞具有分泌多种细胞因子的特点，并且可与多种细胞因子发生反应；而一种细胞因子也可以与多种细胞相互作用。

在炎症性疾病的发生发展过程中，细胞因子之间的调控都发挥着重要作用，尤其是以IL-6、IL-1β、TNF-α和NO为代表的炎症细胞因子的变化更为重要。

正常人血浆中含有多种蛋白酶抑制剂，它约占血浆总蛋白含量的10％[17]。

其中含量最高的是α1-抗胰蛋白酶，主要功能是抑制弹性蛋白酶的活力，其基因缺陷会导致结缔组织过早破坏使肺失去弹性引起肺气肿[17]。

α1-抗胰蛋白酶主要由肝脏合成，是人体血清中最主要的丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有抗炎症和免疫调节等重要作用。

在内毒素引起的急性肺损伤兔模型中，α1-抗胰蛋白酶可抑制中性粒细胞的活化，减缓急性炎症反应；此外，其在脑脊髓炎和胶原诱导的关节炎治疗中也取得良好效果[18,19]。

α1-抗胰蛋白酶除具有抗炎作用外，还可用于多种疾病的治疗，如Daemen等将α1-酸性糖蛋白和α1-抗胰蛋白酶用于缓解肾缺血所引起的组织损伤[20]。

最新研究发现[21]，α1-抗胰蛋白酶具有延长胰岛移植存活时间，抗凋亡和诱导特异性免疫耐受的特性。

进一步调查发现，肥胖及多囊卵巢患者体内的α1-抗胰蛋白酶含量显著降低，且炎症细胞因子IL-6、IL-1β含量与α1-抗胰蛋白酶呈负相关；而在多囊卵巢大鼠模型中，注射α1-抗胰蛋白酶可明显减轻病理状态[22]。

我们推测α1-抗胰蛋白酶可能通过降低炎症细胞因子含量及抑制炎症细胞因子活力而发挥作用。

目前，临床上应用的主要是人血浆纯化获得的α1-抗胰蛋白酶制剂，其成本较高，不利于广泛应用。

自然界中微生物的多样性及其代谢产物的多样性，为人们提供了发现新药的不竭动力，而嗜热微生物及其来源的蛋白质具有较高的稳定性，可以开发更有价值的生物活性物质。

第二章 Pnserpin的表达、纯化与性质表征
2.1 实验材料与仪器
2.1.1 实验仪器
仪器品牌或公司
HZQ-X100恒温振荡培养箱华美生化仪器厂
高速冷冻离心机美国BECKMAN
DQHZ-2001B大容量恒温振荡培养箱华美生化仪器厂
JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎机宁波新芝生物
CR 21GⅢ大容量高速冷冻离心机日本日立公司
CT15RT台式高速冷冻离心机上海天美仪器
Tanon 2500R全自动凝胶图像分析系统上海Tanon公司
制冰机（AF100）Scotman
超滤浓缩离心管MILLIPORE
超净工作台苏州安泰公司
-80℃超低温冰箱海尔公司
-20℃冷冻冰箱海尔公司
4℃冷藏冰箱海尔公司
高压蒸汽灭菌锅博讯（BOXUN）仪器公司电热恒温水浴锅北京市医疗设备厂
电子分析天平上海仪器厂
烘箱上海博讯公司
电泳仪北京君意电泳公司
磁力搅拌器中国南汇电讯器材厂
UV-2550紫外可见分光光度计日本岛津公司
BioTek全功能微孔板检测仪美国伯腾仪器公司
2.1.2 实验试剂
药品与试剂品牌或公司
琼脂糖 OXOID公司
酵母提取物 OXOID公司
胰蛋白胨 OXOID公司
α-糜蛋白酶（CHT）美国Sigma公司
枯草杆菌蛋白酶（SUC）美国Sigma公司
蛋白酶K（PRK）美国Sigma公司
弹性蛋白酶（elastase）美国Sigma公司
凝血酶（thrombin）美国Sigma公司
胰蛋白酶（trypsin）美国Sigma公司
木瓜蛋白酶（Papain）美国Sigma公司
Succiny-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 美国Sigma公司
Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-pNA 美国Sigma公司
D-Val-Leu-Arg p-nitroanilidediacetate salt 美国Sigma公司
异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）美国Sigma公司
Protein Molecular Weight Marker Thermo公司
TritionX-100 北京鼎国昌盛生物科技公司十二烷基硫酸钠（SDS）北京鼎国昌盛生物科技公司Tris碱北京鼎国昌盛生物科技公司卡那霉素（Kanamycin，Kan） Genview公司
质粒DNA小量提取试剂盒宝泰克公司
DNA凝胶回收试剂盒宝泰克公司
BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天公司
限制性内切酶FastDigest NdeI Fermentas公司
限制性内切酶FastDigest BamHI Fermentas公司
2.1.3 菌株及质粒
大肠埃希氏菌E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL为宿主菌，pET-28a为蛋白表
达载体。

2.1.4 培养基
2YT液体培养基、LB液体培养基，LB固体培养基于实验前自行配制。

2.2 实验方法
2.2.1 Pnserpin基因序列分析
在NCBI网站上得到Pnserpin基因序列（GenBank：ACB40836.1）和蛋白质序列，使用ClustalX1.8进行序列比对，通过ESPript3.0在线服务器对序列比对结果进行分析。

2.2.2 Pnserpin和PnCHT的克隆、表达和纯化
Pyrobaculum neutrophilum基因组含有编码α-糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶（GenBank：ACB40794.1）的基因，我们将其命名为PnCHT。

为了确定Pnserpin 对同样存在于Pyrobaculum neutrophilum中的PnCHT是否有抑制活性，我们克隆PnCHT基因，并在大肠杆菌中表达和纯化获得蛋白质（图2.4）。

① Pnserpin和PnCHT基因由上海捷瑞公司（Generay Biotech）合成，经过NdeI和BamHI双酶切后，Pnserpin基因和PnCHT基因分别连接到表达载体pET-28a，并转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-CodonPlus (DE3)-RIL中。

经卡那霉素（Kanamycin，Kan）筛选后，选取阳性转化的单克隆，接种到5ml 2YT液体培养基（100μg/ml Kan）中，37℃，170rpm震荡培养12小时。

将饱和菌液按1%接种到1L的LB液体培养基（100μg/ml Kan）中，37℃，170rpm震荡培养至OD600值为0.8，加入终浓度为1mM的IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷），25℃，120rpm摇动诱导培养18小时，离心（4,000rpm，4℃，30min），收集菌体。

② 50mM pH8.0的磷酸缓冲液（binding buffer，PB）重悬菌体（比例为1:10，如3g菌加30ml缓冲液），待菌体融化后重悬均匀，冰浴超声破碎细胞。

超声功率为200-300W，频率30kHz，工作3秒，间歇3秒，超声总时间20min。

超声破碎后离心（12,000rpm，4℃，30min）除去细胞碎片，回收上清液，作为粗酶液，进行后续蛋白纯化。

③利用重组蛋白N末端含有His-Tag，使用镍亲和层析对重组蛋白进行纯化，所有试剂先过0.45μm滤膜除去杂质，再用超声清洗20min以除去溶液中的气泡，防止堵塞柱料。

④预先在层析柱中装好约2ml介质，使用前先用超纯水冲洗10个柱体积，用于除去保存层析柱所使用的20%乙醇溶液，50mM pH8.0的磷酸盐缓冲液（binding buffer，PB）平衡柱子，加入6-7ml的50mM NiSO4溶液挂镍，再用超纯水将没有挂上的游离镍冲尽，再次用50mM pH8.0 PB平衡柱子，上样，用干净烧杯接流出的样品，重复上样一次，用binding buffer冲洗没有挂上柱子的杂蛋白（加满柱管两次），用10mM咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，并用20mM咪唑洗脱液收集Pnserpin蛋白；用10mM咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，并用300mM咪唑洗脱液收集PnCHT蛋白。

用EDTA（乙二胺四乙酸）脱镍缓冲液将层析柱树脂上的Ni2+洗涤下来，超纯水冲洗柱子后，柱料用20%乙醇封存于4℃冰箱中[23]。

⑤每一步留样进行12%的SDS-PAGE电泳检测确定目的蛋白。

⑥将目的蛋白洗脱液4℃过夜透析，除去溶液中的咪唑，再用超滤管浓缩，得到纯度和浓度都较高的目的蛋白溶液。

⑦ BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，目的蛋白于-20℃保存备用[23]。

2.2.3 Pnserpin抑制动力学常数的测定
2.2.
3.1 Pnserpin抑制化学计量常数的测定
抑制化学计量常数（stoichiometry of inhibition，SI）表示一分子目的蛋白酶受到抑制时所需要的抑制剂的分子数[24]。

本实验中SI值是通过测定20℃-100℃温度范围内，被Pnserpin抑制的目标蛋白酶的残余活力来获得的。

Pnserpin分别与来源于牛胰腺的ɑ-糜蛋白酶（ɑ-Chymotrypsin from bovine pancreas，CHT）、来源于地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶（subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis，SUC）、来源于林伯氏白色念球菌的蛋白酶K(Proteinase K from Tritirachium album，PRK)、来源于猪胰腺的弹性蛋白酶（elastase from porcine pancteas，elastase）、来源于人的凝血酶（thrombin from human，thrombin）、来源于Pyrobaculum neutrophilum的ɑ-糜蛋白酶（ɑ-Chymotrypsin from Pyrobaculum neutrophilum，PnCHT）和来源于木瓜乳液
的木瓜蛋白酶（Papain from papaya protein，Papain）以不同摩尔比孵育。

孵育体系100μl，其中含有80μl 50mM pH8.0 PB，目标蛋白酶溶液10μl，Pnserpin 溶液10μl，所用目标蛋白酶的工作浓度均为50nM。

孵育的温度和时间如下：作用于CHT，thrombin和trypsin：20℃、30℃，60min；40℃，30min；50℃，2min。

作用于SUC、PRK和elastase：20℃、30℃、40℃，60min；50℃，15min；60℃、70℃，1min。

作用于PnCHT：20、40和60℃ 60min；80℃ 30min；100℃ 1min。

SI值测定在96孔板中进行，底物采用Succiny-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Suc-AAPF-pNA)（适用于CHT、SUC、PRK、PnCHT和Papain）、Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-V al-pNA (MeO-SucAAPV-pNA)（适用于elastase）和D-V al-Leu-Arg-p-nitroanilidediacetate salt（适用于thrombin和trypsin），检测体系为100μl，含有80μl 50mM pH8.0 PB，10μl孵育混合物及10μl对应底物[25]。

全功能微孔板检测仪检测水解产物p-nitroaniline（pNA）在410nm处吸光度的变化，每组数据需进行三次独立实验取平均值获得，计算酶的残余活力[26]。

2.2.
3.2 Pnserpin结合速率常数的测定
丝氨酸蛋白酶抑制剂对蛋白酶的抑制是不可逆的，表征抑制复合物的形成和抑制效率的最重要动力学参数是结合速率常数（second-order association rate constants，Kass），Kass反映的是蛋白酶抑制剂与目标蛋白酶形成共价复合物的能力。

本实验中Kass值是通过测定Pnserpin对目标蛋白酶的抑制曲线，由动力学公式进一步求得。

实验在96孔板中进行，反应体系100μl，含有70μl 50mM pH8.0 PB，10μl Pnserpin、10μl目标蛋白酶（CHT、SUC、elastase、PRK、thrombin、trypsin、PnCHT和Papain）和10μl相应底物（Suc-AAPF-pNA、MeO-SucAAPV-pNA和D-Val-Leu-Arg p-nitroanilidediacetate salt）。

反应体系中CHT、SUC、elastase、thrombin、trypsin、PnCHT和Papain的工作浓度均为1nM，PRK的工作浓度为0.001nM。

Pnserpin作用于CHT、SUC、elastase、PRK、thrombin、trypsin和PnCHT的浓度梯度为：0nM、50nM、75nM、100nM、125nM和150nM；作用于Papain的浓度梯度为：0nM、30nM、60nM、90nM、120nM、150nM；作用于PRK的浓度梯度为：0nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM和0.5nM。

实验反应温度：CHT、SUC、elastase、PRK、thrombin、trypsin、PnCHT 和Papain 40℃；PnCHT 80℃。

使用全功能微孔板检测仪检测水解产物pNA在410nm处吸光度
的变化，每组数据需进行三次独立实验，获得吸光度值随时间变化的曲线，
OriginPro8.0拟合曲线获得吸光度值变化斜率。

同时测定CHT、SUC、elastase、PRK、thrombin、trypsin、PnCHT和Papain 40℃和PnCHT 80℃条件下的米氏常数（michaelis constant，Km）值[27]。

测定Pnserpin对目标蛋白酶的抑制曲线，使用OriginPro8.0软件，根据动
力学公式：
P=(V0/Kobs)×(1-e-Kobs*t) （1）【P为产物形成的量，V0为初始速度，t为反应时间，拟合获得曲线斜率即为一级缔合速率常数（Kobs）】。

根据动力学公式：
△△
(Kunc=Kobs/[I]) （2）表观二级结合速率常数Kunc是由Kobs和Pnserpin的浓度来决定的，由于抑制剂和底物是竞争性的，具有底物亲和性，Kass需由Km进一步修正，所以Kass由动力学公式：
Kass=Kunc× (1+[S]/Km) （3）进一步计算获得[28]。

2.2.4 Pnserpin性质表征
2.2.4.1 Pnserpin的热稳定性
Pnserpin在不同温度下孵育15min后，冰浴30min，测定残余活力。

反应体系为100μl，含有70μl 50mM pH8.0 PB，10μl 孵育混合物，10μl 目标蛋白酶（CHT、SUC、PRK、elastase、thrombin、trypsin和PnCHT）和10μl底物。

使用全功能微孔板检测仪检测水解产物pNA在410nm处吸光度的变化，每组数据需进行三次独立实验，计算Pnserpin的抑制活力[29]。

2.2.4.2 Pnserpin的pH稳定性
Pnserpin在不同pH下孵育24h，进行Pnserpin活力测定时，反应体系为100μl，含有70μl 50mM pH8.0 PB，10μl 孵育混合物，10μl 目标蛋白酶（CHT、SUC、elastase、PRK、thrombin、trypsin、PnCHT和Papain）和10μl 底物。

测定在96孔板中进行，使用全功能微孔板检测仪检测水解产物pNA在410nm处吸光度变化，每组数据需进行三次独立实验，计算Pnserpin的抑制活力[30]。

2.2.5 Pnserpin与蛋白酶相互作用
2.2.5.1 SDS-PAGE分析Pnserpin与蛋白酶形成的复合物
Pnserpin与目标蛋白酶（CHT、SUC、elastase、PRK和PnCHT）以不同摩尔比（[I]/[E]=0.5、1、2和4）混合孵育，孵育条件为：CHT、SUC、elastase、℃；PnCHT 80 2min
℃，加入SDS样品缓冲液后煮沸10min终止PRK 502min
反应，15% 的SDS-PAGE电泳鉴定[31]。

2.2.5.2 酪酶谱分析Pnserpin对蛋白酶活力的抑制作用
Pnserpin与目标蛋白酶（CHT和SUC）以摩尔比为20:1于40℃下孵育30min，加入SDS样品缓冲液后煮沸10min终止反应。

进行酪酶谱鉴定，配制采用含有0.1%（V/V）酪蛋白（casein）的15%分离胶，电泳后采用100mM pH7.5 Tris-Hcl，2.5%（V/V）TritionX-100洗涤液对胶洗涤30min使蛋白复性，使用100mM pH7.5 HEPES-NaOH，10mM CaCl2或者100mM pH 10.0 Glycine-NaOH,10mM CaCl2缓冲液清洗凝胶20min，然后把胶放入和上一步清洗所用的相同缓冲液中，37℃孵育24h，孵育结束后0.05%考马斯亮蓝染色3h后脱色鉴定[32]。

2.3 实验结果
2.3.1 序列分析
我们从嗜热古菌Pyrobaculum neutrophilum的基因组中检索到一个可能的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（GenBank：ACB40836.1），编码基因全长393个氨基酸（Pnserpin）。

Pnserpin与其它丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列比对（图2.1）表明其具有丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员的大部分高度保守的残基，符合丝氨酸蛋白酶抑制剂序列特征：Pnserpin在铰链区中存在丝氨酸蛋白酶抑制剂高度保守的丙氨酸重复基序（346-351氨基酸位点处，A TAA TA），这是丝氨酸蛋白酶抑制剂的特征基序，所以Pnserpin可能是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。

Pnserpin与来自极端嗜热微生物Pyrobaculum aerophilum的aeropin蛋白具有51％的相同氨基酸序列。

aeropin的丝氨酸蛋白酶切割位点对应于Pnserpin的V al357-Cys358，因此，我们推测Pnserpin的P1和P1'位点可能是位于反应中心环中的V al357和Cys358处。