番茄红素对高糖诱导的足细胞自噬以及凋亡的影响

番茄红素对高糖诱导的足细胞自噬以及凋亡的影响
黎妮;杨向利;黄巧;贾琳;刘昌璇;李永霞;陈文莉
【摘要】Objective To investigate the effects of lycopene (Lyc) on high glucose-induced autophagy and apoptosis of podocytes in order to provide a reliable theoretical basis for the clinical treatment of diabetic nephropathy.Methods The immortalized mouse podocyte line was used as the study subjects,and the high glucose-induced podocytes were intervened by the addition of different doses of lycopene.The experimental cells were divided into 6 groups:control group (5.5 mmol/L glucose),hyperosmolar group (5.5 mmol/L glucose + 19.5 mmol/L mannitol),high glucose group (25 mmol/L glucose),high glucose + low dose Lyc group (25 mmol/L glucose + 3.125 μmol/L Lyc),high glucose + middle dose Lyc group (25 mmol/L gluco se + 6.25 μmol/L Lyc) and high glucose + high dose Lyc group (25 mmol/L glucose + 12.5 μmol/L Lyc).After culture for 48 h,the autophagic changes of the cells were observed by acridine orange staining.The flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of each group,and the expression levels of LC3-Ⅱ,beclin-1,p62/SQSTMI mRNA and protein were detected by Real-Time PCR and Western blotting,respectively.Results The number of autophagosomes in the high glucose group was significantly greater than that in the normal glucose group and high permeability group.The apoptosis rate of the cells in high glucose group was significantly higher (P ＜0.01).The expression of autophagy-related genes LC3-Ⅱ and beclin-1
was significantly increased (P＜0.05),while that of p62/SQSTMI gene was significantly decreased (P ＜ 0.05).As compared with the high glucose group,the number of autophagosomes in different doses of lycopene group was significantly increased;the apoptosis rate of the cells was significantly reduced (P＜0.05),and the apoptosis rate of the cells in high glucose + high dose lycopene group was extremely significantly decreased (P＜0.01).The expression of autophagy-related genes LC3-Ⅱ and beclin-1 was significantly increased (P＜0.05).The expression of p62/SQSTMI gene was significantly reduced (P＜ 0.05),and that in high glucose + high dose lycopene group was decreased extremely significantly (P＜0.01).The results of Western blotting on the protein level were consistent with those of RT-PCR.Conclusions Lycopene can further enhance the autophagy of podocytes induced by high glucose,but it still inhibits the apoptosis of podocytes,and the effect of high-dose lycopene is more obvious.%目的探讨番茄红素(Lyc)对高糖诱导的足细胞自噬及凋亡的影响,旨在为临床治疗糖尿病肾病提供可靠的理论依据.方法采用条件永生化小鼠足细胞系为研究对象,通过添加不同剂量的Lyc对高糖诱导的足细胞进行干预.实验细胞分6组,分别为正常对照组(5.5mmol/L葡萄糖)、高渗对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)、高糖组(25 mmol/L葡萄糖)、低剂量Lyc组(25 mmol/L葡萄糖+3.125 μmol/L Lyc)、中剂量Lyc组(25 mmol/L葡萄糖+ 6.25 μmol/L Lyc)和高剂量Lyc组(25 mmol/L葡萄糖+12.5 μmol/L Lyc).在细胞培养48 h后,用吖啶橙染色法观察各组细胞的自噬体变化情况;流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率变化;采用实时定量荧光PCR和蛋白质印迹法分别检测自噬相关基因LC3、beclin-1、p62/SQSTMI mRNA和蛋白的表达变化情况.结果与正常对照组、高渗对照组相比,高糖组细胞
中的自噬体数目明显增多,细胞的凋亡率极显著增加(P＜0.01),自噬相关基因LC3-Ⅱ、beclin-1的表达量显著增加(P＜0.05),而p62/SQSTMI基因的表达量则显著降低(P＜0.05).与高糖组比较,不同剂量Lyc组中的足细胞自噬体数目更多;细胞的凋亡率显著降低(P＜0.05),且高剂量Lyc组细胞的凋亡率降低极显著(P＜0.01);自噬相关基因LC3-Ⅱ、beclin-1表达量显著增加(P＜0.05);而p62/SQSTMI基因表达量则显著降低(P＜0.05);且高剂量Lyc组基因表达量变化极显著(P＜0.01);蛋白水平上的检测结果与mRNA水平基本一致.结论 Lyc能进一步增强高糖诱导引起的足细胞的自噬,但对足细胞的凋亡却起到了一定的抑制作用,且高剂量的Lyc作用效果更加明显.
【期刊名称】《临床肾脏病杂志》
【年(卷),期】2018(018)001
【总页数】6页(P48-53)
【关键词】足细胞;番茄红素;高糖;自噬;细胞凋亡
【作者】黎妮;杨向利;黄巧;贾琳;刘昌璇;李永霞;陈文莉
【作者单位】430014 武汉市中心医院肾内科;430014 武汉科技大学附属天佑医院泌尿外科;430014 武汉市中心医院肾内科;430014 武汉市中心医院肾内科;430014 武汉市中心医院肾内科;430014 武汉市中心医院肾内科;430014 武汉市中心医院肾内科
【正文语种】中文
糖尿病肾病(DN)是糖尿病引起的严重并发症，是糖尿病患者致死或致残的重要原
因之一[1]。

近些年，关于肾小球滤过屏障结构和功能的改变在DN的研究中已成热门。

足细胞是体内一种高度分化的细胞,定位于肾小球基底膜外侧,其胞体可伸出较自身长度数倍的一级和次级足突,环绕在肾小球表面。

作为肾小球滤过屏障的最后一层结构,足细胞对维持肾小球滤过功能具有重要作用[2]。

足细胞损伤在DN发病中被认为是引起蛋白尿和肾小球硬化的关键，因此研究足细胞结构及功能损伤对于揭示DN的发生具有指导作用[3]。

自噬是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新[4]。

细胞凋亡则是指细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，也是细胞内新陈代谢的一种重要途径[5]。

LC3、beclin-1、p62/SQSTMI均为自噬相关基因，当细胞自噬能力加强时，LC3的I型受体LC3-I会逐渐向II型受体转化，导致LC3-I表达量降低，而LC3-II的表达量则上升，beclin-1的表达量也会随之增加，而p62/SQSTMI则因为结合泛素化蛋白导致表达量降低[6-8]。

这3个基因均可作为自噬发生的测定指标。

番茄红素(Lyc)是一种黄/红色类胡萝卜素，广泛存在于自然界中。

研究表明，作为一种天然的色素，Lyc具有诸多利于人类健康的生理活性，如抗癌活性，抗氧化活性，免疫增强活性，预防心血管疾病等[9]。

近些年在DN的研究中，Lyc也逐渐成为热门之一，但其对于细胞自噬作用在DN的影响研究还比较少。

本研究通过体外构建高糖诱导足细胞模型来模拟糖尿病的高糖症状，研究不同浓度的Lyc干预对高糖环境下足细胞自噬、凋亡的影响，进而探究Lyc在治疗DN上的潜在功能。

材料和方法
一、实验材料
条件永生化小鼠足细胞系来自武汉华联科生物技术有限公司，Lyc、葡萄糖和甘露醇购自美国Sigma公司，RPMI 1640细胞培养基和胎牛血清均购于美国Gibco
公司，BCA蛋白浓度检测试剂盒购自南京建成公司，高灵敏ECL化学放光试剂盒
购自南京建成公司，兔一抗LC3、beclin-1、p62/SQSTMI、GAPDH、二抗羊抗
兔IgG均来自Abcam公司，细胞RNA提取试剂盒购自南京建成公司，吖啶橙购自美国Sigma公司，SYBR green荧光染料购自美国Lumiprobe Corporation
公司，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自南京建成公司。

二、足细胞的复苏、传代和分化
1.复苏取出装有足细胞的冻存管，置于37 ℃温水中快速晃动约2 min令其融化，经酒精消毒后拧开瓶盖，用移液管轻轻吸取细胞悬液于事先备好的装有培养基的离心管中，混匀后1 000 r/min离心10 min，弃上清，用条件培养液悬浮细胞后接种于铺有明胶的25 cm2的细胞培养瓶中，于33 ℃、5% CO2的培养箱中培养，次日观察细胞贴壁后，换培养液继续培养。

2.传代当细胞长至约80%融合时，弃培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2～3次，后加入0.25%胰蛋白酶消化细胞,2～3 min后，用吸管轻轻吹打贴壁细胞，使之脱落成细胞悬液，后收集悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清，条件培养液重
悬细胞并吹打成单细胞悬液，再分装到培养瓶中，于33 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

3.分化将上述细胞进行消化处理，后用分化培养液悬浮后转入铺油明胶的培养瓶中，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养2周，使其分化成熟后用于实验。

三、足细胞的培养
1.接种取在分化培养液中贴壁生长良好的足细胞，经消化处理后，用适量分化培
养液悬浮，进行细胞计数，按每孔1.0×105个细胞接种至6孔板中，每孔加分化
培养液2 ml，后置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

2.同步化弃上清液，用PBS冲洗2～3次后加入含2%胎牛血清的RPMI 1640细
胞培养液，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h后用于实验。

四、实验分组
将上述同步化后的细胞分成以下6组培养48 h：①正常对照组给予5.5 mmol/L
葡萄糖；②高渗对照组给予5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇[10]；③高糖组给予25 mmol/L葡萄糖；④低剂量Lyc组给予25 mmol/L葡萄糖+3.125
μmol/L Lyc；⑤中剂量Lyc组给予25 mmol/L葡萄糖+6.25 μmol/L Lyc；⑥高
剂量Lyc组给予25 mmol/L葡萄糖+12.5 μmol/L Lyc。

五、吖啶橙染色观察自噬体
上述各组细胞培养48 h后，取等量转移至含吖啶橙6 μg/ml的无血清培养基中培养20 min，收集细胞，后用PBS冲洗3次，荧光显微镜下观察各组细胞自噬情况。

六、流式细胞技术检测细胞凋亡率
各组足细胞培养48 h后，取等量用胰酶处理收集细胞，制备活的细胞悬浮液，1 000 r/min离心10 min弃上清液，后用PBS冲洗3次，收集细胞。

按照Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒进行如下操作：用试剂盒中的结合缓冲液悬浮细胞，使浓度达到1.0×106个/ml，再在避光冰浴环境下加入试剂盒中
的Annexin V-FITC和PI染料各2 μl，混合均匀后避光孵育15 min，后尽量在1 h内上机检测细胞凋亡，每组检测3次。

七、RT-PCR检测
各组足细胞48 h培养后，取等量用胰酶处理收集细胞。

根据primer 5.0设计三个基因及内参GAPDH的RT-PCR引物如下表1，按照细胞RNA提取试剂盒进行足细胞总RNA的提取，后进行质量检测和浓度测定，PCR反转录成模板cDNA。

RT-PCR反应体系：SYBR green染料10 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA模板0.5 μl，Taq酶0.5 μl，1 μl dNTP，ddH2O 7μl，总体系20 μl。

反应程序：95 ℃预变性3 min，35循环(95 ℃变性15 s，53 ℃退火30 s，68 ℃延伸45 s)。

结果采用ΔCt法，以2-ΔΔCt值表示对应基因的相对表达量。

表1 引物序列基因名称上下游引物序列(5′⁃3′)退火温度(Tm/℃)LC3⁃IIF：ACCTTCAAGCAGCGCCGGAGR：GGCAATAAACCATGTACAGG53℃beclin⁃1F：GGAGGAGGAGAGGCTGATCCR：
GGAGCAGCAGCACTGTCTGG54℃p62/SQSTMIF：AGAAGATTCAGAAGGGAGAGR：GTCCAAAGACTTCAATGAAG53℃GAPDHF：AAGCCCATCACCATCTTCCAR：CCTGCCTCACCACCTTCTTG53．5℃
八、Western Blot检测
分别收集各组细胞，提取总蛋白，然后用BCA蛋白定量试剂盒对所提蛋白进行浓
度检测，取20 μg蛋白和4 μl 2×SDS上样缓冲液混合均匀，100 ℃变性10 min；上样，SDS-PAGE凝胶电泳分离后转至PVDF膜上；PBS洗膜；用5%脱脂牛奶
封闭1 h；PBS洗膜后加入对应一抗(LC3-II，1∶2 000；beclin-1，1∶2 000；
p62/SQSTMI，1∶200)4 ℃，孵育过夜；PBS洗膜；加入辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗兔IgG(1∶2 000)孵育0.5 h；PBS洗膜；用ECL化学放光进行显色。

以GAPDH为内参蛋白，后采用Quantity One图像分析软件进行半定量分析。

九、统计学处理
采用统计学软件SPSS 19.0进行分析处理，均以均数±标准差形式表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学有意义。

结果
一、吖啶橙染色
染色结果显示，正常对照组与高渗对照组的足细胞自噬体显示出正常的绿色荧光；4个高糖模型组与正常对照组、高渗对照组比较，自噬体的自噬能力增强，内部出现较强的橙色荧光；3个Lyc干预组与高糖组比较，足细胞内自噬体数目显著增多，且出现更加明显的砖红色荧光，其中在高浓度的Lyc干预下，砖红色荧光更加明显。

(图1)
注：Control为正常对照组，HP为高渗对照组，HG为高糖组，LowLyc为低剂量Lyc组，MiddleLyc为中剂量Lyc组，HighLyc为高剂量Lyc组图1 Lyc对高糖
诱导的足细胞自噬体的影响
二、流式细胞技术检测细胞凋亡率
检测结果显示，细胞培养48 h后，正常对照组和高渗对照组的细胞凋亡率无明显变化且维持在较低水平；高糖的刺激使足细胞的凋亡率呈极显著上升趋势，但随着Lyc对足细胞的干预，凋亡率又有明显的下降。

(图2)
三、相关mRNA的表达
mRNA水平检测结果显示，与正常对照组与高渗对照组比较，高糖组足细胞中
LC3-II、beclin-1基因的表达量均显著增加(P<0.05)，而p62/SQSTMI基因的表
达量则显著降低(P<0.05)；与高糖组对比，低、中剂量Lyc组细胞中自噬相关基
因LC3-II、beclin-1表达量显著增加(P<0.05)，且高剂量Lyc组基因表达量增加
极显著(P<0.01)；而对于p62/SQSTMI基因而言，低、中剂量Lyc组与高糖组比较表达量则显著降低(P<0.05)，高剂量Lyc组基因表达量降低极显著(P<0.01)。

(图3)
四、相关蛋白的表达
蛋白水平上的检测结果与mRNA水平的检测结果基本一致，LC3-II、beclin-1作为自噬能力增强的指示蛋白，其表达量随着高糖诱导以及Lyc的干预呈逐渐增加
趋势；而作为自噬能力减弱的指示蛋白p62/SQSTMI的表达变化情况则正好相反。

(图4)
讨论
DN的发病机制与多种因素密切相关，近些年的假说研究主要集中在以下几个方面：糖代谢紊乱(多元醇代谢通路的活化、蛋白激酶C的激活、糖基化终末产物的积累)，氧化应激，细胞因子参与，血流动力学异常以及遗传因素等，但其具体机制尚无统
一定论。

细胞自噬是普遍存在于真核细胞内的一种自我保护机制,通过清除细胞中
的代谢产物、大分子物质以及受损伤的细胞器来维护细胞的稳定性[11]。

而对于DN而言，足细胞损伤是引起蛋白尿发生发展的重要环节之一，研究发现自噬对于维持足细胞自身的稳态、控制DN恶化具有积极作用。

例如，研究者通过对小鼠
的Atg5基因进行敲除后发现，该类小鼠容易患肾小球疾病，提示自噬活性的降低与足细胞、肾小管损伤有关[12]。

此外，通过体外实验发现，血糖升高会引起足细胞自噬行为的改变，高糖刺激下足细胞的LC3-Ⅱ表达增加；动物实验还发现，电
镜下与正常组相比，DN大鼠模型中可以观察到足细胞中自噬体体积增大且数量明显增多[13]。

而本实验通过构建高糖诱导的足细胞损伤模型，结果发现高糖诱导下，足细胞凋亡率显著上升，足细胞的自噬能力明显增强，自噬增强相关蛋白表达量升高，而自噬减弱相关蛋白表达量明显减少，与上述研究者结果有共同之处，说明促进自噬作用对于维持足细胞稳态十分重要，这对于治疗DN具有积极的指导作用。

注：与HG组比较，aP<0．01，bP<0．05。

图2 48h各组足细胞凋亡率变化注：与HG组比较，aP<0．05，bP<0．01。

图3 各组足细胞LC3、beclin⁃1、
p62/SQSTMI基因的mRNA水平表达
注：与HG组比较，aP<0．05，bP<0．01。

图4 各组足细胞LC3⁃II、Beclin⁃1、p62/SQSTMI蛋白表达量
目前，调控自噬已成为治疗DN的新思路，具体机制主要是通过调控mTOR、AMPK、Sirt1等的表达从而影响自噬活性，进而减轻足细胞损伤。

例如，研究发
现腹腔注射mTOR抑制剂雷帕霉素，可以使得糖尿病小鼠自噬标志物LC3-
Ⅱ/LC3-Ⅰ值明显增加，足细胞数量增加，自噬能力增强，高糖刺激下系膜细胞的损伤得到进一步缓解[14]。

通过对自噬调控药物-二甲双胍的研究发现，与DN模
型组大鼠相比，二甲双胍处理组大鼠LC3-Ⅱ表达上升，p62/SQSTM1的表达减
少，提示其可以激活AMPK，抑制mTOR的表达，从而增强自噬活性[15]。

而中
药治疗DN不良反应少，效果明显，具有一定的优势。

李春花等[16]用白藜芦醇干预DN大鼠模型，发现白藜芦醇组自噬标志物Beclin-1和LC3-Ⅱ明显升高，AMPK/Sirt1通路被激活，自噬活性增强从而发挥保护肾脏的作用。

刘淑萍[17]通过黄连素干预体外培养的足细胞，发现黄连素在2.5 μM时即发挥保护足细胞的作用，但10 μM时对足细胞具有杀伤作用，且具体机制可能是通过调控AMPK-mTOR信号通路，增强足细胞自噬，从而减轻足细胞损伤。

赵辛元等[18]发现姜
黄素可以明显降低DN大鼠的血肌酐、尿素氮，减少24h尿蛋白含量，上调LC3-Ⅱ蛋白，下调TGF-β1、p62蛋白，提示姜黄素可能通过抑制氧化应激、调控自噬发挥保护肾脏的作用。

而Lyc作为具有多种免疫功能的天然色素，近年来在预防
和治疗疾病的研究上报道也颇多，通过研究Lyc对小鼠乳腺癌的作用，发现Lyc
可以显著抑制乳腺癌细胞增殖[19]。

同时能有效抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠生存时间，增强脾脏T淋巴细胞增殖活力，提高自然杀伤细胞的杀伤活性[20]。

Lyc还可以提高机体抗氧化酶活力，降低脂质过氧化，从而拮抗四氯化碳引起的氧化损伤，对大鼠急性肝损伤有一定的保护作用[21]。

此外，Lyc对细胞自噬能力同样具有一定的促进作用。

例如，对于缺氧损伤的心肌细胞来说，Lyc提高了心肌细胞Sirt1
在蛋白和mRNA水平上的表达，通过Sirt1激活自噬，增加心肌缺氧时自噬相关
基因Beclin1和LC3蛋白的表达，来减少心肌细胞的缺氧损伤[22]。

在对大鼠肝
脏缺血-再灌注损伤模型的研究中发现，Lyc通过提高大鼠缺血-再灌注肝脏自噬水平，降低血清ALT/AST水平并减轻炎症反应以及减少肝细胞凋亡从而起到保护缺血-再灌肝损伤[23]。

在Lyc对慢性铁负荷大鼠氧化应激及肝细胞自噬的相关研究
中也发现，一定剂量的Lyc饲喂处理能有效改善慢性铁负荷引起大鼠的氧化应激
损伤，增强机体抗氧化能力。

同时，降低肝脏中铁诱导的氧化压力、线粒体膜的改变和肝细胞的自噬，具有一定的保护作用[24]。

本实验研究结果显示，Lyc对高糖
诱导的足细胞自噬能力具有增强作用，对足细胞的凋亡则具有一定的抑制作用，且高剂量的Lyc的作用效果更加显著，而Lyc激活自噬保护足细胞免受损伤的具体机制还有待进一步研究。

综上所述，Lyc良好的体外细胞实验效果进一步证明了其在细胞水平上对高糖诱导的足细胞损伤的缓解作用是通过促进足细胞自噬能力而实现的，这将为进一步的体内实验奠定扎实基础，为今后的DN的预防和临床治疗提供新的干预手段。

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