生物化学实验预习及实验报告

实验还原糖和总糖的测定
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一、实验原理
生物组织中普遍存在的可溶性糖种类较多，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖，前实验部分3种糖的分子内都含有游离的具有还原性的半缩醛羟基，因此称为还原性糖；蔗糖的分子内没有游离的半缩醛羟基，因此称为非还原性糖，不具有还原性。

利用溶解性质不同，可将生物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。

在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸共热，3，5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅成比例关系，在520nm 波长下测定棕红色物质的吸光度，通过标准曲线，便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。

多糖水解时，在单糖残基上加了一分子水，因而在计算中须扣除已加入的水量，测定所得的总糖量乘以0.9即为实际的总糖量。

二、实验用品
1.器材
①刻度试管或比色管、②刻度吸管、③大离心管或玻璃漏斗、④恒温水浴锅、⑤烧杯、⑥离心机、⑦容量瓶、⑧电子天平、⑨分光光度计、⑩三角瓶
2.试剂
①1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖(预先在80℃烘至恒重)，置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用；
②3，5-二硝基水杨酸试剂：将 6.3g3，5-二硝基水杨酸和262 mL 2 mol/L NaOH溶液，加到500 mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解；冷却后加蒸馏水定容至1000 mL，贮于棕色瓶中备用；
③碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中；
④酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中；
⑤ 6mol/L HCI溶液；
⑥ 6mol/L NaOH溶液。

3.材料
水果、蔬菜、植物干样品、面粉等。

三、实验操作步骤
1.葡萄糖标准曲线的制作。

取7支25mL，具塞比色管，编号，按下表加入试剂：
将各管摇匀，在沸水浴中加热5 min，取出后用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25 mL，混匀。

在520nm波长下，用0号管作对照，分别测定1~6号管的吸光度，绘制标准曲线。

2.样品中还原糖和总糖的提取
(1)还原糖水提取法
新鲜植物样品洗净擦干，切成小块，用组织捣碎机捣成匀浆，准确称取10~20g 匀浆，用蒸馏水洗入250mL容量瓶中。

若样品呈酸性，则用稀碱调至中性。

如系磨细的风干样品，可准确称取1.00g，放在100 mL烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加50~60ml蒸馏水，中和酸性操作同上。

在80℃水浴中保温20 min，使还原糖浸出。

保温后冷却至室温，容量瓶中定容至100 mL，摇匀后过滤，滤液作为还原糖待测液。

(2)还原糖乙醇提取法。

对含有大量淀粉和糊精的样品，用水提取会使部分淀粉、糊精溶出影响测定，同时过滤也困难，为此，宜采用乙醇溶液提取。

将研磨成糊状的样品用100 mL80%乙醇洗入蒸馏瓶中，装上回流冷凝管，接通冷凝水。

在80℃水浴上保温提取3次，第一次30 min，后2次15 min，3次提取的上清液一并倒入另一蒸馏瓶，在85 ℃水浴上蒸去乙醇。

也可在40~45 ℃水浴上进行减压蒸馏，直至乙醇提取液只剩3~5mL，用水洗入250 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，作为还原糖待测液。

用乙醇溶液作为提取剂时，不必去除蛋白质，因为蛋白质不会溶解出来。

(3)总糖的水解和提取。

准确称取10g新鲜植物样品(或2g面粉)，置100 mL的三角瓶中，加入10 mL 6 mol/L HCI溶液及15 mL蒸馏水。

置于沸水浴中加热水解30min，取1~2滴水解液于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液，检查水解是否完全。

如已水解完全，则不显蓝色。

待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，以6 mol/L NaOH溶液中和至微红色，将溶液全部收集在100 mL 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀后过滤。

精确吸取10 mL滤液，移入另一100 mL的容量瓶中，定容至刻度，混匀后作为总糖待测液。

3.还原糖和总糖的测定。

取4支25 mL具塞比色管，编号，按下表加入试剂：
加入试剂后，其余操作与制作葡萄糖标准曲线时相同。

以制作标准曲线的0号管为对照，测定各管吸光度。

四、实验记录及计算结果
计算公式：
1、碱性酒石酸铜的标定：
F = C × 标V
F ——10ml 碱性酒石酸铜溶液相当于
G 的量，mg
C ——标准G 溶液的浓度，mg/ml
标V ——标定时消耗标准G 溶液的平均体积，mL
2、总糖含量：
1001000V m V F %⨯⨯⨯⨯=样品总样品
总糖（以葡萄糖计）
m ——样品重量，g
总样品V ——总糖样品溶液的总体积 mL
样品V ——测定时消耗样品溶液的平均体积，mL
1000——mg 换算成g 的系数
3.在标准曲线上分别查出相应的还原糖和总糖的浓度，按下式计算出样品中还原糖和总糖的含量。

五、结果与讨论
（就实验中出现的问题、思考的问题、取得实验好或不理想结果的原因、需要注意的事项、改进的地方等进行讨论）。