工业微生物产生菌的分离筛选(四)

工业微生物产生菌的分离筛选（四）
各种微生物对养分要求和培育条件是不同的,在分别筛选时若在这两个方面加以调整掌握,就能获得更好的分别效果.
1. 培育基的养分成分
各种微生物对碳源、氮源要求各异,有的对养分还有特别的要求,事先了解被分别微生物的养分要求,从而设计一个合理快速的分别培育基,能够收到事半功倍的效果.
放线菌是生产抗生素和酶制剂的重要来源.在选择分别放线菌时,
通常采纳改良的HV琼脂培育基、土豆-胡萝卜水汁液培育基和淀粉
琼脂培育基能取得较好的效果.但不同菌种对养分要求差别很大,如
奴卡氏菌在有氧条件下用一般培育基即可分别到,而以色列放线菌则在有CO2存在且有相宜培育基的状况下才能正常生长繁殖.
筛选水解酶产生菌时,通常利用以底物为惟一碳、氮源的平板进行分别,如以淀粉为碳源的培育基可鉴定菌落能否产生淀粉酶；一种含纤维素粉为碳源的分别培育基,可以鉴别纤维素酶产生菌；用含有酪蛋白为有机氮源的平板培育基,可以鉴别蛋白酶的产生菌.纯种分别时,把以上琼脂平板置于相宜的温度培育肯定的时间,如具有产生水
解酶力量的菌株,便在菌落四周形成水解圈或呈色圈,依据圈的大小
可初步推断酶活力强弱.测定水解圈直径与菌落直径之比,把比例大
的菌落移入斜面保藏,供进一步筛选.
2. 培育基的pH
细菌、放线菌的生长繁殖对pH一般要求偏碱,霉菌和酵母菌要
求偏酸.因此,分别培育基的pH应当调整到被分别微生物要求范围.
这不仅有利于自身生长,也可排解一部分不需要的菌类.例如,分别柠檬酸产生菌的黑曲霉,就是利用调整培育基的酸碱度获得胜利的.其
分别方法是：取红芋粉醪20%、柠檬酸 10%～20%配成培育液,调整pH2.0～2.5,以肯定量的培育基和土样匀称混合,用毛细吸管点种在
平皿内事先掩盖的无菌滤纸上（2～3层）,于30℃培育,这样可以
分别到产生柠檬酸的黑曲霉.
分别碱性蛋白酶和碱性脂肪酶产生菌时,可以把培育基调到pH9～11,在此范围内不宜生长的微生物被抑制,这对分别本身起到浓缩作用.大多数水解酶的生长最适pH基本相近,而酶的作用pH未必与产
酶pH相同.
培育基的pH要结合养分成分和培育条件来考虑.由于微生物在
生长繁殖过程中,由于代谢作用会产生酸性或碱性产物,pH发生变化,微生物生长受到抑制.一般培育基中碳氮比（C/N）高者,培育后倾向于酸性,反之则倾向于碱性.无机盐的性质也会影响pH变化,（NH4）2SO4是生理酸性无机氮源,其中NH4+被菌体利用,留下SO42-,培育
液变成酸性.而NaNO3是生理碱性氮源,其中NO3-被菌体分解利用后,剩余Na+,使培育液变成碱性.如发酵过程缺氧,则代谢向有机酸合成方向进行,pH下降.为了维持培育基的PH,一般要加磷酸盐,如
K2HPO4、KH2PO4,使培育基具有肯定的缓冲力量.假如培育液中的酸
碱变化很大,磷酸盐的缓冲容量不足以调整pH变化,则可适当加入碳
酸钙,以不断中和菌体代谢过程中产生的酸类,使培育基的pH能保持在恒定的范围内.此外,在分别霉菌时,加几滴乳酸不仅可以维持肯定酸碱度,而且可以抑制细菌的生长.
3. 排解不需要的菌类
实行调整pH的方法来抑制非目的微生物的生长,虽然能起到肯定的作用,但并不是对全部的菌类都有效.有些细菌和放线菌同样可以在酸性环境下生长,而个别的霉菌,也同样可以在中性或偏碱的培育基中生长.为了更有效地抑制非目的微生物的生长,要加入一些专一性的抑制剂.
（1）分别细菌时,在培育基中加入浓度为50U/ml制霉菌素,可以抑制霉菌和酵母菌的生长.
（2）分别放线菌时,在样品中加入0.05%十二烷基磺酸钠（SDS）不仅可以抑制细菌的生长,还能激活放线菌孢子的萌发.加入氟哌酸（5mg/L）+ 制霉菌素（50mg/L）+ 青霉素（0.8mg/L）也可以有效地抑制细菌和真菌,而不影响放线菌的生长.
（3）分别霉菌和酵母菌时,在培育基中加入青霉素、链霉素和四环素各30U/ml,可以抑制细菌和放线菌生长.
（4）分别根霉和毛霉时,由于这些微生物的菌丝易扩散成片,难以得到纯化的菌落,通常在培育基中添加0.1%去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝扩散,使菌落长得小而紧密.
一般用于分别单一目的微生物的培育基中均含有抑制其他微生物的抑制剂,这些专用的抑制剂在小型试验室配制较麻烦,现已有成品
供应,只要直接加入基础培育基即可.如氨苄西林,主要用于分别亲水
气单孢菌.
4. 掌握培育温度
掌握培育温度,也是一种获得目的微生物的有效措施.各类微生
物生长温度不同,从大范围来看,可分三大类：一类是高温微生物,最
适温度在50～60℃.假如要分别这类菌可将分别培育基置于50～60℃温度下培育,能抑制一些嗜冷、中性微生物生长,可以有效地分别到
高温菌类.其次类是中温微生物,它们的最适生长温度是20～40℃,
超过50℃,就停止生长.这类微生物最为常见,、数量都占首位.工业
发酵微生物绝大多数都属于此类.其中不同类群微生物对温度又有所
差别,一般细菌、放线菌最适温度为25～37℃,霉菌和酵母最适温度
为20～28℃.第三类为低温微生物,它们的最适温度为15℃或更低.
当从样品中分别各种菌类时,分别置于自身最适温度下培育也可大体
上抑制另一些微生物的生长.当分别某些特别产物的微生物时,对温
度的选择还需考虑某些内在的关系,如在筛选不饱和脂肪酸产生菌时,由于细胞膜中所含的不饱和脂肪酸含量越高,其凝固点越低,即细胞
在较低温度下仍能表现出活力,因此在低于正常温度10℃下分别效
果最好.。