高通量测序技术解析扳倒井浓香型白酒窖泥原核微生物群落结构

第48卷第3期2021年5月
V o1.482q4
May,2021酿酒
LIQUOR MAKING
文章编号：1002-8-0(2021)03-0081-05
高通量测序技术解析扳倒井浓香型白酒窖泥原核微生物
群落结构
于文娟，许玲,杨庆振，于盼盼,姜明慧，董乔娟，白秀彬，赵纪文*
(山东扳倒井股份有限公司，山东高青256300)
摘要:通过Illumina Miseq2X300bp高通量测序技术对山东扳倒井股份有限公司浓香型白酒窖泥原核微生物
群落结构进行了研究。

发现：窖泥中细菌主要为梭菌纲(Clostridia)j拟杆菌纲(Bacteroidia)、甲烷杆菌纲
(Methanobacteria)和芽S杆菌纲(Bacilli);古菌主要为甲烷微菌纲(Methanomicrobia)、甲烷杆菌纲
(Methanobacteria)和热原体纲(Thermoplasmata)o同时得出窖池位置对窖泥原核微生物群落结构的丰冨度和多样
性影响最大，压池时间越长窖泥菌落结构的丰富度和多样性越高，多粮发酵窖泥菌落结构与单粮发酵窖泥菌落
结构既有特异性也保持相关性O
关键词:浓香型白酒t窖泥；高通量测序t原核微生物t群落结构
中图分类号:TD262.311TS261.1文献标识码:A
Analysis of Prokaryotic Microbial Community Structure in Pit Mud of Bandaojing Luzhou Flavor Liquor by High Throughput Sequencing YU We—juan,XU Ling,YANG Qingzhe—,YU Panqa—JIANG Minyhui,DONG Qiaojuan,BAI Xiudin,
ZHAO JiweX
(Shandong bandaojing Ce.,Lth.,GaoqWg256340,Sha-dong,China)
Abstract:The pyXamo—c microPial community strpctuy of Luzhox eaver—-per pit mud in Shandong bandaojing Ce.,Lth,was studie—by Elumina miseq2X300BP high-thyuahput seque—cing technology,It was found that the bacteya in pit mud were mainly cds—ifia, bacteroifia,methadoPacteya and bacillus,and he Archaea were mainly methanom—rokia,methadoPacteya and thermop dstwaW.At the same time,—is coucluhe—shat the locadou of p—has the greatest W—uencc on the ychnes s and diversity of prokayo—o m—rokiai communi—shychro in pit mud.The d—ger the pressure hwe is,the higher he abuhdance and diversity of mWrokiai communi—struchiy in pit mud of multi grain Ormeqtatiou and that of single graix ermectatiou pit mud have both specif c ity and correladou,
Key words：Luzhox eaver-quor;pit mud;High throuahput seque—cing;Prokayodo microoryanism;Community s—uchro
白酒酿造过程实质上是多种微生物繁殖和代谢的过程,它是在环境微生物、大曲微生物、窖池微生物的作用下，以窖池为容器酒醅为原料经过复杂的物质能量代谢过程发酵生产2,2浓香型白酒是我国白酒中最重要的香型之一，它具有绵柔甘洌、芳香浓郁、香味协调、尾净余长、入口甜、落口绵等特点。

窖泥是酒醅发酵微生物的载体之一，其复杂的微生物菌群不断进行自然选择与淘汰，最终形成特有的微生态环境。

窖泥作为白酒发酵环境中的重要物质，其厌氧环境下富集的功能微生物可产生多种对酒体有贡献的风味成分。

经过长期驯化和演替而逐渐形成的窖泥微生物菌群极为复杂，且窖泥环境中可培养的微生物含量极低，大量的微生物不能培养或者难以培养，传统的分离培养方法用于研究窖泥微生物菌群具有较大局限性。

高通量测序不仅具有高通量、高覆盖、高准确率的特点，还可以全面地定性和定量的揭示样品微生物菌群组成和多样性信息現因此,利用高通量测序分析窖泥微生物菌群具有重要的意
收稿日期:2021—01—21
作者简介：于文娟(1986—)，女，大专，生物技术及应用专业，山东扳倒井股份有限公司微生物研究室专工
#通信作者:赵纪文，山东扳倒井股份有限公司董事长，总经理,教授级高工。

5—
第三期画良酒2020
义4p
1材料与方法
1.1材料、试剂及仪器
窖泥：取自山东扳倒井股份有限公司白酒酿造车间五个不同位置窖池窖泥。

仪器设备:Illumina Misep2x300Up高通量测序平台(生工生物工程上海股份有限公司)。

1.2试验方法
064取样方法
选取五个不同位置窖池,将每个窖池窖壁中间、下部及窖底泥取样后混合。

062高通量测序分析方法
生工生物工程上海股份有限公司利用Alumina Misep2X300U u高通量测序平台测序。

用检测后的合格的基因组DNA稀释后作为模板。

细菌PCR扩增采用19S V3-V4可变区的引物，古菌扩增V3-V4区,采用的是巢式PCR°
扩增序列通过Alumina Misep2X320bp高通量测序平台进行测序,下机数据经过cotakapiC去除接头)、PEAR(序列对拼)、PUnseq(质量剪切)，去除得分低于20分、碱基模糊、引物错配或测序长度小于150bp的序列。

经过上述步骤后，将标签分组具有97%序列相似性的高质量的OTU序列，细菌和古菌得到的每个OTU代表序列比对RDP数据库、shva数据库和NCBI16S数据库。

2结果与分析
2.1群落丰度和多样性分析
2X4菌群相对丰度
不同位置窖泥微生物群落中各种微生物群落均匀分布，其中第一跨区(JN-)和第三跨区东边(JN-5)中甲烷短杆菌属(MetdanoPrevidacter/占据优势分别为3626%和2222%,过道以南(JN-3JN-4)优势菌株为梭菌属(C—stPd—m W)、甲烷短杆菌(MetdanoPrevidacter)和瘤胃球菌科未分类菌属(un-classOief Ruminococcaceve),窖泥样本JN-2所在窖池紧挨过道故与其他四个窖泥样本有显著差异性,其优势菌株为硫还原菌(Pet—monas2224%)°据有关资料显示，新窖泥中乳酸杆菌属含量较高,老窖泥中乳酸杆菌属的优势地位下降，同时老窖泥中降解乳酸的菌属增多，进一步导致了老窖泥中乳酸的减少,进而促进了窖泥pH升高，逐渐趋于中性,最终有利于噬中性菌属(氨基杆菌属AminoPactewum、沉积菌属SePioe-tidacter等)的生长4。

HU X等4应用AluminaMisep技术对江苏汤沟浓香型白酒优质、普通和退化窖泥中细菌多样性进行了分析，研究发现随着窖泥质量的提升，乳酸菌属含量显著减少，而梭菌属、氨基酸杆菌等核心属的含量明显增加；罗雯等3借助高通量测序技术探讨了四川某知名浓香型白酒生产厂不同性状窖泥的微生物结构组成，研究同样发现趋老熟、老熟窖泥中梭菌属优势较为明显。

翟磊等报道称瘤胃球菌属主要参与丁酸等有机酸的合成，增加浓香型白酒中的呈香物质4。

由此可知过道以南的JN-3JN-4窖泥样本更符合优质老窖泥的细菌群落结构。

JN-0和JN-3的优势古菌菌株是甲烷短杆菌分别是4322%和422%,JN-2的优势古菌菌株是甲烷八叠球菌属和甲烷球菌属分别是3462%和3425%,JN-4的优势古菌菌株是甲烷囊菌属(4521%),JN-5的优势古菌菌株是甲烷八叠球菌属(3561%)°据有关报道32年窖龄窖泥属于较为老熟的窖泥，老窖池中古菌群落研究较多的是甲烷菌。

检测到30年窖龄窖泥中主要优势古菌菌落是广古菌门下热原体科和甲烷杆菌科另有报道介绍，古井贡老厂优质窖泥中甲烷囊菌(Methanocol—xs)的相对含量远远高于新厂普通窖泥(最高达4000多倍)，作为优势甲烷菌存在于浓香型白酒的窖泥。

2X6a-多样性分析
表1细菌多样性指数分析
Samp—Number OTUs Shannop Chno Ahe Simpson Shannopeven Covemge JN-17527542336948465737600R506400 JN-2731-g419361454654752506506000 JN-37319147236953061519.4706406500 JN-472201459369483694356906506200 JN-5758604593294332243425069065
00
第三期于文娟，等:高通量测序技术解析扳倒井浓香型白酒窖泥原核微生物群落结构2020
由表0可知对五个窖泥样本中细菌进行测序,共获得351625条序列,聚类分析共产生2233个0-TU分类。

通过5个样本的对比分析,样本的Shannop 指数排序JN-3（368）＞JN-4（3K8）＞JN-2（361）＞JN-5（3K6）＞JN-（3A8）,表明过道以南窖池细菌群落多样性高于过道以北窖池（四跨＞五跨〉三跨〉一跨）；通过样本Chool指数和ACE指数排序JN-3＞JN-2＞JN-5＞JN-＞JN-2，表明过道以南细菌群落物种的丰富度高于过道以北窖池（四跨＞五跨＞三跨〉一跨）,JN-2由于紧挨过道所以细菌群落物种的丰富度最小;而JN-1样本的Simpsox指数最大，为0R5,则说明该窖泥样本的群落多样性最低;5个样本的Coverage指数均为120%,说明试验的取样是合理的，测序结果能反映样本的真实情况°
302。

JN-0和JN-2独有的细菌OTU数目都是3；JN-3独有的细菌OTU数目是5；JN-4独有的细菌OTU数目是4；唯一的多粮浓香型白酒窖泥样本JN-5独有的细菌OTU数目是4,是五个样本中独有细菌OTU数目最多的，凸显了该样本微生物菌群的复杂性和特殊性，其他样本均为单粮浓香型白酒窖泥。

由图2可知五个样品共有的古菌OTU数目是59,各样品没有独有古菌OTU数目。

2.2样本相似和差异性分析
2.4X0-多样性分析
-1
-2
-3
-4
-5
N
N
N
N
N
H
H
H
'
0.00.2
PcoA1(52.08%)
图3细菌PCoA主坐标分析图
-O.
T
-27
-4
-5
JN
JN
JN
JN
JN
-0.2-0.10.00.10.2
PcoA1（52.08%）
图4古菌PCoA主坐标分析图
通过图3可以观察NJ-3、NJ-4、NJ-5距离比较接近，说明这三个样品细菌群落组成结构相似, NJ-1、NJ-2距离较远，细菌群落结构差异很大。

通过图-可以观察NJ-1、NJ-3、NJ-5距离比较接近，说明这三个样品古菌群落组成结构相似，NJ-2、NJ-4
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第三期画良酒2021
距离较远，古菌群落结构差异很大。

22A相关性分析
图5细％genus水平样本相关性热图
图6古菌genus水平样本相关性热图
由图5可知JN-1窖泥样本在细菌genus水平与其他四个样本都有较亲密的相关性;JN_2窖泥样本只与JN-1有较疏远的相关性；JN-3与JN-D JN-5有较亲密的相关性,与JN-4有较疏远的有相关性;JN-4与JN-12N-5有较亲密的相关性;由图6可知JN-1窖泥样本在古菌genus水平只与JN-3有较亲密的相关性;JN-3与JN-12N-5有较亲密的相关性;JN-5只与JN-3有较亲密的相关性。

综上所述在五个窖泥样本的相似性和差异性方面分析，紧挨过道的窖泥JN-2与其他四个样本无论在细菌还是古菌genus水平不仅相似性很低而且差异性也很大，而唯一一个多粮浓香型窖泥样本JN-5 84除了在物种分布韦恩图中表现出了复杂性和特殊性外，在群落结构和样本相关性方面分析与其他样本相似性很高。

JN-3是压池度夏时间最长的窖泥样本，在古菌群落结构和样本相关性方面分析与其他样本相似性很高。

3结论
生物多样性是生态系统稳定性的基础，窖池中较高水平的生物多样性有利于窖池生态系统功能的发挥。

山东扳倒井酒厂窖泥细菌集中分布在梭菌纲(Clostridia)2拟杆菌纲(BacteroWW)、甲烷杆菌纲(Metha—odacteha)和芽抱杆菌纲(Caci—i),这与勾文君1等报道的江苏洋河酒窖泥细菌集中分布在梭菌纲(Cdsthdia)、拟杆菌纲(BacteroWW)、互营养菌纲(Sy—ergisha)和芽抱杆菌纲(Caci—i)略有不同,与任聪20等报道的浓香型白酒窖泥中细菌主要是芽抱杆菌纲(Caci—i)与梭菌纲(Clostridia)更不同，说明山东扳倒井酒厂窖泥细菌有一定的独特性。

上述4个纲细菌为所有窖泥样品共有，其含量占各自窖泥样品细菌总量的75%以上，覆盖了窖泥样品的大部分微生物，表明这4个纲的微生物可以反映绝大部分窖泥细菌的信息。

梭菌纲(Clostridia)细菌代谢生成的丁酸及己酸，拟杆菌纲(BacteyidW)微生物产生的乙酸、丙酸等物质对酒体形成起重要作用，甲烷杆菌纲(Metha—odacteria)在窖泥中发挥重要的作用，催化H 和CO-产生甲烷，从而解除了累积的H-对酸代谢的反馈抑制作用，提高了浓香型白酒主要香味成分己酸乙酯的含量4-2
古菌集中分布在甲烷微菌纲(Metha—omicypia)、甲烷杆菌纲(Metha—oPacteya)和热原体纲(Thermo—plasmata),这与邓杰等报道的泸州某浓香型酒厂窖泥样品中古菌分布于3个纲，分别是热原体纲(Thermoplasmata)、甲烷杆菌纲(Metha—odacteria)和甲烷微菌纲(Metha—omicypia)是相同的，与他报道四川绵阳丰谷酒业窖泥样品中古菌分布于热原体纲(Thermoplasmata)、甲烷杆菌纲(Metha—odacteria)和甲烷球菌纲(Methanococci)略有不同Z4D+、古菌可以承受高热、高盐度、缺氧的极端环境,所以短时间古菌多样性指数波动较小,但由于长时间的发酵驯化,对窖泥中古菌进行筛选(特别是高酸度的环境条件。

,虽然古菌的属的种类变化较小，但其各个属的优势度变化较大，适应于窖池发酵环境和能发挥相关功
第三期于文娟，等：高通量测序技术解析扳倒井浓香型白酒窖泥原核微生物群落结构2020
能的菌种优势度增加43。

通过Alumina Misep2X300bp高通量测序对跨区不同、压池时间不同、粮食发酵种类不同的五个窖泥样本的分析进行研究，可知窖池位置对窖泥群落结构的丰度和多样性影响最大，压池时间越长窖泥菌落结构的丰度和多样性越高，多粮发酵窖泥菌落结构与单粮发酵窖泥菌落结构既有特异性也保持相关性。

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(上接80页)
试验，结果显示活性较高的为4粗提物。

用高效凝胶过滤色谱分离4粗提物，多次分段收集G0-G7流分，分别浓缩、冻干后进行降血压体外活性试验。

结果表明G3流分活性较高，因此用反相柱分离G3流分,多次分段收集得到5个流分，分别冻干后进行体外降血压活性试验,R4、R5、R6活性较高，对ACE 的抑制率分别为856%、926%和922%°
662活性肽的LC-MS/MS分析
将反相柱上收集的活性肽流分R5冻干后水溶，进行MALDI-TOF-TOF-MS分析，测得主要母离子分别为575K3、304X8和234X2,序列分别为VEDGGV、PST和NT,即VaOGO-Asp-G—-G—-Va—P—-Se—Th—Asn-Thr。

对活性肽流分R4进行分析，得到2个小肽,为LY(即Lex-Tyr)和PST。

除上述6种生物活性肽外‘HAN49等人借助U-PLC-ESI-MS/MS方法对古越龙山黄酒中的小肽进行了研究,分离鉴定出500多种小肽的氨基酸组成及序列，与已有文献报道中活性肽的氨基酸组成及序列进行对比，认定其中43种为潜在的生物活性肽。

黄酒的酿造过程，涉及谷物原料以及多种微生
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