莲子草假隔链格孢毒素Vulculic Acid的合成

莲子草假隔链格孢毒素Vulculic Acid的合成
陈迁;叶柳;孙媚华;施祖荣;向梅梅;周遗品;宋光泉
【摘要】Vulculic acid是从莲子草假隔链格孢(Nimbya alternantherae)的代谢产物中分离得到的一种真菌毒素,它对空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)等多种杂草有致病活性,是一种潜在的除草活性物质. 本文报道了Vulculic acid的化学合成. 从可商业购买的3,4,5-三甲氧基苯乙酸出发,经甲酯化、傅克乙酰化、脱三甲基化、选择性上单甲基化以及水解等5步反应合成了目标产物,总产率为21%. 生物活性测试结果表明,合成的Vulculic acid对空心莲子草有致病活性,所致症状与天然Vulculic acid一致.
【期刊名称】《高等学校化学学报》
【年(卷),期】2010(031)010
【总页数】5页(P2010-2014)
【关键词】莲子草假隔链格孢;真菌毒素;Vulculic acid;化学合成
【作者】陈迁;叶柳;孙媚华;施祖荣;向梅梅;周遗品;宋光泉
【作者单位】中国科学院广州生物医药与健康研究院,广州,510663;中国科学院广州生物医药与健康研究院,广州,510663;仲恺农业工程学院,广州,510225;仲恺农业工程学院,广州,510225;仲恺农业工程学院,广州,510225;仲恺农业工程学院,广州,510225;仲恺农业工程学院,广州,510225
【正文语种】中文
【中图分类】O625.5;Q936;O621.3
近年来，研究杂草病原真菌代谢产物的毒素物质，以寻找新的天然除草剂化合物或为仿生合成新型除草剂提供依据，已成为农田杂草生物防治研究的热点之一［1～4］.莲子草假隔链格孢（Nimbya alternantherae）是从空心莲子草（Alternanthera philoxeroides）中分离得到的一种叶斑病菌，它对空心莲子草
有较好的控制作用，且寄主专一性强，是一种潜在的空心莲子草生物防治真菌［5，6］.研究发现，该病菌代谢产物中含有一种毒素化合物Vulculic acid［7，8］，
该毒素是一种非寄主专化性毒素，可导致空心莲子草叶片变褐及植株萎蔫，对其它多种杂草也有致病活性.本课题组［8，9］对莲子草假隔链格孢毒素Vulculic acid 的分离纯化与结构鉴定、致病机理及生物测定等方面进行了系列研究.自Kimura
等［10］发现该毒素以来，关于它的化学合成尚未见报道，本文从可商业购买的
原料3，4，5-三甲氧基苯乙酸（1）出发，通过5步反应合成了Vulculic acid. 1.1 试剂与仪器
3，4，5-三甲氧基苯乙酸（化合物1，纯度97%）为 Alfa Aesar公司产品;其它试剂均为国产分析纯试剂.柱层析用硅胶为上海五四化学试剂有限公司产品;Vulculic acid标准样品由本课题组从空心莲子草叶片中分离纯化得到.
硅胶板由上海信谊仪器厂生产;Bruker Avance AV 400 MHz及100 MHz核磁共
振波谱仪;Agilent1200/MSD液-质联用仪.
1.2 Vulculic acid的合成方法从起始原料3，4，5-三甲氧基苯乙酸（1）出发，经甲酯化、傅克乙酰化、脱三甲基化、选择性上单甲基化以及水解等 5 步反应合成
得到 Vulculic acid（6，Scheme 1）.中间体 2［11～13］，3［14，15］和 5［10］均为已知化合物，具体合成步骤如下.
1.2.1 化合物2的合成将3，4，5-三甲氧基苯乙酸（1，15.0 g，66 mmol）溶
解于150 mL无水甲醇中，于室温下缓慢滴入二氯亚砜（7.2 mL，99 mmol）.反应1.5 h后，缓慢加水进行淬灭反应，浓缩蒸去甲醇，再加入饱和碳酸氢钠水溶液
将浓缩液调为中性，然后将水层用乙酸乙酯萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥.
浓缩得到无色油状物（化合物2，15.3 g，96%）.ESI-MS:m/z:241（M++H）.
谱图数据与文献［11～13］报道一致.
1.2.2 化合物3的合成参照文献［16］方法，将化合物2（3.0 g，12.5 mmol）
溶解于30 mL无水二氯甲烷中，将溶液冷却至0℃，再依次缓慢滴入四氯化锡（3.3 mL，27.5 mmol）和乙酰氯（1.5 mL，20 mmol）.滴加完毕后，将反应液在0℃下继续反应1 h，然后于室温下搅拌过夜.将反应液冷却至0℃后，加入二氯甲烷（40 mL）稀释，再缓慢加入碳酸氢钠饱和水溶液（20 mL）进行淬灭反应.
最后用水以及饱和食盐水洗涤混合液，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，用硅胶色谱柱［淋洗剂:V（石油醚）/V（乙酸乙酯）=10/1］分离得到无色油状物（化合物3，2.7 g，76%）.ESI-MS:m/z:283（M++H），281（M+－H）.谱图数据与文
献［12］报道的结果一致.
1.2.3 化合物4的合成参照文献［17］方法，将化合物3（2.0 g，7.1 mmol）溶解于30 mL无水二氯甲烷中，在－10℃下缓慢滴入三溴化硼（3.3 mL，35 mmol），自然升温至室温下反应0.5 h后，于0℃下缓慢滴入水进行淬灭反应，
浓缩蒸去二氯甲烷，加入饱和碳酸氢钠水溶液将水相调为pH=5，将水相用乙酸乙酯萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶色谱柱［淋洗剂:V（石油醚）/V（乙酸乙酯）=1/1］分离得到白色固体（化合物 4，1.4 g，82%）.m.p.122～123℃;1H NMR（400 MHz，CD3OD），δ:6.24（1H，s），3.64（3H，s），3.61（2H，s），2.54（3H，s）;13C NMR（100 MHz，CD3OD），δ:205.6，174.5，149.5，149.4，133.1，126.8，120.5，112.0，52.4，40.3，32.4;ESI-MS，m/z:241（M++H），239（M+－H）.
1.2.4 化合物5的合成参照文献［18］方法，将化合物4（0.43 g，0.8 mmol）
溶解于8 mL乙醇中，加入溶解于水（5 mL）中的Na2B4O7·10H2O（0.76 g，
1.97 mmol），搅拌30 min后，再加入碳酸钾（0.3 g，
2.15 mmol）和硫酸二甲酯（0.21 mL，2.15 mmol）.将反应液于室温下搅拌过夜后，加入稀盐酸调
pH=2，再用乙酸乙酯萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶色谱柱［淋洗剂:V（石油醚）/V（乙酸乙酯）=1/1］分离得到无色油状物（化合物5，0.29 g，65%）.ESI-MS，m/z:255.1（M++H），253.1（M+－H）.谱图数据与文献［10］报道的结果一致.
1.2.5 Vulculic acid（6）的合成将化合物5（90 mg，1.79 mmol）溶解于4 mL 甲醇中，然后加入氢氧化钾水溶液（1 mL，4 mol/L），于室温下搅拌过夜.加入稀盐酸将反应体系调为酸性，浓缩蒸去甲醇，水层用乙酸乙酯萃取3次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶色谱柱［淋洗剂:V（石油醚）/V（乙酸乙酯）
=1/2］分离得到白色固体，为 Vulculic acid（化合物6，46 mg，54%）.ESI-MS，m/z:241.1（M++H），239.0（M+－H）.谱图数据与文献［8，10］报道的结果一致.
2.1 合成方法
合成的第一步反应为保护化合物1上的羧基，反应以96%的产率得到甲酯2.然后通过傅克酰基化反应在苯环上引入一个乙酰基，得到化合物3，分离产率76%.接着用三溴化硼脱除3个甲氧基上的甲基得到三酚羟基化合物4，分离产率82%.值得注意的是，通过对该反应的粗产品进行质谱检测发现，存在化合物4进一步水解的产物（ESI-MS，m/z:227），而且反应时间越长，水解产物越多.实验发现，该反应的最佳时间为室温下反应0.5 h.第4步反应是在芳环C5位的酚羟基上选择性地接入1个甲基.据文献［19，20］报道，硼砂水解产生的B（OH）4－可与相邻的双羟基以共价配键相结合，形成具有四面体结构的螯合物，并释放出H+离子.因此，在实验中选择硼砂作为螯合剂，以实现选择性的酚羟基甲基化.该反应单一选择性地以65%的产率得到了所需化合物5，且未检测到其它甲基化产物.化合物
5的 1H NMR和 13C NMR与文献［10］报道的数据吻合，另外，通过化合物5的NOESY谱图发现，由于活泼的酚羟基在氘代甲醇中没有信号，甲氧基上的氢原子只与芳环C6上的氢原子发生了关联（图1），证明了化合物5结构的正确性，而化合物5'的甲基则不能与芳环氢发生关联.
化合物4之所以能够区域选择性地转化为化合物5，而未得到化合物5'，可能是由于硼砂水解产生的B（OH）4－既可与化合物4中的相邻酚羟基螯合后生成A 和B两个中间体，还可与C3上的酚羟基及其相邻乙酰基螯合生成中间体 C，而中间体 B和 C可以进一步与 B（OH）4－螯合生成中间体D（Scheme 2）.这样，芳环C3和C4上的酚羟基均被保护起来，而只有C5上的羟基能够发生甲基化反应.
最后一步反应是甲酯5水解，在碱性条件下反应，以54%的产率得到了目标化合物Vulculic acid（6）.在前期的研究［8］提出已经从莲子草假隔链格孢代谢产物中分离得到了高纯度的Vulculic acid，并利用元素分析、红外光谱、1H NMR、13C NMR和DEPT、HMQC、HMBC以及 1H-1H COSY等手段对其结构进行了完全确认.本文合成的 Vulculic acid的 1H NMR和 13C NMR与本课题组［8］以及 Kimura等［10］报道的数据吻合.
2.2 合成产物的生物活性
以空心莲子草为材料，用离体叶片针刺法测定了合成产物的生物活性，所用浓度为50，100和150 μg/mL，对照样品为相同浓度的天然Vulculic acid和蒸馏水，结果见表1.在合成化合物中，除终产物Vulculic acid对空心莲子草叶片有较强的致病活性外，化合物5也表现出一定的活性，但均不及天然Vulculic acid的活性强.
综上所述，本研究实现了莲子草假隔链格孢毒素Vulculic acid的化学合成，由可商业购买的3，4，5-三甲氧基苯乙酸为起始原料，通过5步反应完成其合成，总
产率为21%.
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