高效液相色谱法同时测定复方牛黄贴中胆红素和奥硝唑含量

高效液相色谱法同时测定复方牛黄贴中胆红素和奥硝唑含量李为;李喜平;张程亮;徐艳娇;冯承阳;陈鹰;刘东
【摘要】目的建立高效液相色谱(HPLC)法同时测定复方牛黄贴中胆红素和奥硝唑含量.方法采用HypersilODS2色谱柱(4.6 mm×200 mm,5μm),以乙腈-1％醋酸为流动相,梯度洗脱,检测波长:胆红素450 nm,奥硝唑315 nm,柱温为30℃,进样体积:10 μL.结果胆红素在1.58～51 μg·mL-1浓度范围内,线性关系良好(r=0.999 2),低、中、高浓度平均加样回收率分别为96.70％,97.92％,98.13％,RSD分别为1.15％,1.41％,0.36％.奥硝唑在3.22-103μg·mL-1浓度范围内,线性关系良好
(r=0.999 0),低、中、高浓度平均加样回收率分别为
97.83％,98.31％,99.47％,RSD分别为0.97％,0.79％,0.64％.结论该法专属性强、精密度好、准确性高,具有良好的稳定性,可用于复方牛黄贴中胆红素和奥硝唑的含量测定.
【期刊名称】《医药导报》
【年(卷),期】2016(035)010
【总页数】4页(P1101-1104)
【关键词】牛黄贴,复方;奥硝唑;胆红素;色谱法,高效液相
【作者】李为;李喜平;张程亮;徐艳娇;冯承阳;陈鹰;刘东
【作者单位】广州军区武汉总医院药剂科,武汉430070;湖北中医药大学,武汉430065;华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部,武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部,武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部,武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部,武汉
430030;广州军区武汉总医院药剂科,武汉430070;华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部,武汉430030
【正文语种】中文
【中图分类】R286;R927.2
牛黄(Calculus Bovis，CB)是天然来源于牛科动物牛的干燥胆结石，始载于《神农本草经》，用于热病神昏、中风痰迷、惊抽搐、癫发狂、咽喉肿痛、口舌生疮等。

由于其资源短缺，近现代开发出体外培育牛黄(Calculus BovisSativus，CBS)和人工牛黄两种替代品并逐渐广泛应用于临床。

CBS的功效和药理作用与天然牛黄相近[1]，而且在解热、镇痛、抗炎等方面疗效有明显优势。

奥硝唑作为新一代广谱抗厌氧菌的硝基咪唑类抗菌药，对牙周病原菌作用比甲硝唑更强，不良反应更小[2-3]。

将二者制成口腔贴膜剂，不仅能综合二者优点，还能直接作用于创面，可提高口腔溃疡的治愈率，但目前笔者尚未见此方面研究。

2010年版《中华人民共和国药典》和文献利用分光光度法分别测定CBS中胆红素含量和奥硝唑含量作为质量控制方法，但分光光度法灵敏度低，且未见同时测定方法。

因此，笔者采用高效液相色谱(HPLC)法建立同时测定复方牛黄贴中胆红素和奥硝唑含量的质量控制方法，报道如下。

1.1 仪器2690型Waters高效液相色谱仪，含全波长扫描紫外检测器；Hypersil ODS2色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)(大连依利特分析仪器有限公司)； MS105DU分析天平(NewClassic MF，北京宇成伟业有限公司，感量：
0.01 mg)。

1.2 药品与试剂复方牛黄贴(批号：141104，141106，141107)，奥硝唑对照品(中国食品药品检定研究院，含量：99.5%，批号：100608-201102)；胆红素对照品(中国食品药品检定研究院，含量：98.5%，批号：100077-200805)；甲
硝唑(中国食品药品检定研究院，含量：99.9%，批号：100191-200606)；复方
牛黄贴(自制)；甲醇和乙腈为色谱纯级试剂，三氯甲烷、冰醋酸均为分析纯级试剂(国药集团化学试剂有限公司)；水为超纯水。

2.1 色谱条件选用Hypersil ODS2色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，以乙
腈(A)-醋酸溶液(1%，B)为流动相，梯度洗脱，梯度洗脱程序：0～5 min，
25%A；～6 min，25%→98%A；～16 min，98%A；～17 min，
98%→25%A；～20 min，25%A。

采用双波长法，检测波长：胆红素为450 nm，奥硝唑和内标甲硝唑为315 nm；柱温：30 ℃，流速1.0 mL·min-1，进样体积：10 μL。

2.2 溶液的制备
2.2.1 内标溶液的制备精密称定内标物甲硝唑1.70 mg，置于10 mL量瓶中，加三氯甲烷适量溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得170 μg·mL-1内标液。

2.2.2 对照品溶液的制备精密称取胆红素对照品0.51 mg和奥硝唑对照品1.03 mg，分别置于10 mL棕色量瓶中，加三氯甲烷溶解，定容，分别制备得到胆红素51 μg·mL-1和奥硝唑103 μg·mL-1母液。

分别取两种母液相同体积混和，然后
依次倍比稀释得到胆红素浓度分别为25.5，12.75，6.32，3.16，1.58 μg·mL-1，奥硝唑浓度分别为51.5，25.75，12.86，6.43，3.22 μg·mL-1，取胆红素和奥硝唑混合系列溶液200 μL加入20 μL甲硝唑内标液混匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备取复方牛黄贴1片(1 cm2)，剪碎，于锥形瓶中加适量三氯甲烷-甲醇-磷酸(75：25：0.18)混合溶液溶解，超声15 min，放冷[4]，经孔径0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液，用上述混合提取溶剂定容于10 mL棕色量瓶，然后将其稀释5倍，取稀释后溶液200 μL加入甲硝唑内标液20 μL混匀，即得供试品溶液。

2.2.4 空白溶液的制备取复方牛黄贴的空白膜一片(1 cm2)，剪碎，于锥形瓶中
加适量三氯甲烷-甲醇-磷酸(75：25：0.18)混合溶液溶解，超声15 min，放冷，
经孔径0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液，用上述混合溶液定容于10 mL棕色量瓶，然后稀释5倍，即得空白溶液。

2.3 方法学验证
2.3.1 专属性实验取空白溶液，内标(甲硝唑170 μg·mL-1)，对照品混合溶液(胆红素51 μg·mL-1和奥硝唑103 μg·mL-1)及供试品溶液，按“2.1”项下色谱
条件分别进样，记录色谱图。

供试品中两种成分保留时间均与奥硝唑和胆红素对照品以及内标甲硝唑的色谱保留时间一致，互无干扰。

见图1。

2.3.2 线性关系的考察分别取对照品系列溶液按“2.1”项色谱条件进样，测定奥硝唑峰面积(A1)和胆红素峰面积(A2)与甲硝唑峰面积之比(Ai)，以对照品峰面积与内标物甲硝唑峰面积的比(A)对浓度(C)进行线性回归。

胆红素和奥硝唑线性方程如下：A胆=0.092 1C+0.077 4，r=0.999 2；A奥=0.040 7C-0.043，r=0.999 0。

胆红素在1.58～51 μg·mL-1范围内峰面积和浓度的线性关系良好，奥硝唑在3.22～103 μg·mL-1范围内峰面积和浓度的线性关系良好。

2.3.3 精密度实验配制线性范围内胆红素奥硝唑混合溶液，取混合液200 μL加甲硝唑20 μL混匀，得胆红素35.45 μg·mL-1、奥硝唑88.18 μg·mL-1混合溶液，取10 μL进样，连续进样5次，记录色谱图峰面积，根据峰面积与内标物峰面积
的比计算浓度，分别计算胆红素和奥硝唑RSD。

进样分析后，计算得胆红素RSD
为1.11%，奥硝唑的RSD为0.91%。

2.3.4 稳定性实验取同一份供试品溶液，于室温(20～25 ℃)下放置，在5 h内间隔40 min重复进样，每次进样10 μL，重复操作5次，记录峰面积，计算测得峰面积与内标物峰面积的比RSD。

进样分析后，测得胆红素RSD(分别为0.56%，1.02%，1.15%，0.76%，0.69%(n=5)；奥硝唑RSD分别为1.47%，1.04%，
0.79%，0.83%，0.42%(n=5)，表明混合溶液在5 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性实验精密称取同一批号复方牛黄贴，共5片，每片按“2.2.3”项下方法，依法测定，根据峰面积比计算每片复方牛黄贴胆红素的含量及RSD。

测
得胆红素的平均含量为每片0.863 mg，RSD为1.47%，奥硝唑的平均含量为每
片2.96 mg，RSD为1.54%(n=5)。

2.3.6 回收率实验精密称取奥硝唑对照品0.66 mg和胆红素对照品0.49 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用三氯甲烷溶解并定容，作为对照品储备液。

按“供试
品溶液的制备”处理3份样品，然后与储备液按(4：6，5：5，6：4)配制溶液，
混匀，取混合液200 μL加甲硝唑内标液20 μL进样，计算测得量及回收率RSD。

回收率结果见表1。

胆红素低、中、高浓度平均回收率分别为96.70%，97.92%，98.13%；RSD分别为1.15%，1.41%，0.36%；奥硝唑低、中、高浓度平均回收率分别为97.83%，98.31%，99.47%；RSD分别为0.97%，0.79%，0.64%。

2.3.7 样品测定结果按“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液并稀释5倍，取稀释液200 μL加内标液20 μL混匀，并取10 μL进样，记录色谱图。

按内标法计算。

结果3批供试品(批号：141104，141106，141107)胆红素含量测定结果分别为100.58%，102.43%，99.65%，奥硝唑含量测定结果分别为99.66%，98.99%，101.69%。

3.1 方法的选择目前关于胆红素的测定主要有HPLC法、偶氮法、分光光度法、酶化学法和薄层扫描等；奥硝唑的测定方法主要是分光光度法、HPLC法和荧光法。

两种物质在单独测定时，其已有的分析方法具有很强的专属性，但用于复方制剂时，采用 HPLC法可能实现两种物质的分离和同时测定，因此笔者采用HPLC法对复
方牛黄贴中的胆红素和奥硝唑测定方法学进行考察，结果证明该方法稳定、灵敏可靠、准确度高，可以满足复方牛黄贴的分析定量和后续累积释药率和透皮吸收等相关测定实验的需要。

3.2 溶剂的选择CBS中胆红素分为结合型胆红素和游离型胆红素，结合型胆红
素主要是一些胆红素钙和胆红素蛋白聚合物等，它们难溶于水和有机溶剂；游离型胆红素由于具有折叠的分子结构而不溶于水，易溶于三氯甲烷和二甲亚砜[5]，而
奥硝唑在有机溶剂中具有良好的溶解性。

二甲亚砜及溶解胆红素的混合溶剂二甲亚砜-乙腈(7：3)和三氯甲烷-二甲亚砜-甲醇(2：2：1)，同时溶解胆红素和奥硝唑时溶液有悬浮颗粒[6-7]，加热到40 ℃时溶液变为澄清，加热过程可导致胆红素的加速分解。

笔者采用纯三氯甲烷溶解，溶液澄清，而且溶液5 h内稳定。

但应注意，在配制胆红素和奥硝唑混合对照溶液的过程中仍然需要全程避光，尽可能快速完成配制过程，现配现用，以减小因胆红素分解带来的误差。

3.3 流动相梯度的选择通过查阅文献和2010年版《中华人民共和国药典》，
发现可用甲醇-乙腈-2%醋酸或乙腈-1%醋酸体系作为流动相测定CBS中胆红素的含量。

使用Inertsil ODS-3柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，以甲醇-乙腈-2%醋酸体系为流动相时，由于胆红素和奥硝唑的极性差异较大，在胆红素的优化流动相条件下，奥硝唑保留时间不到2 min，而在奥硝唑的优化条件下，胆红素50 min内未出峰，因此采用梯度洗脱。

笔者在本研究选用极性较小的乙腈-1%醋酸体系作为流动相，以延迟奥硝唑出峰，避免奥硝唑因出峰过快可能会受到供试品溶液中相关物质，如蛋白等的干扰；考虑到流动相极性减小，还不能显著加快胆红素出峰，因此选用了更短的Hypersil ODS2色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)。

刘东(1969-)，男，湖南长沙人，主任药师，博士，研究方向：临床药学与药动学。

电话：************，E-mail：******************。

【相关文献】
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[3] 唐明，肖晓蓉，章锦才，等.三种硝基咪唑类药物对牙周病原菌的抗菌活性比较[J].临床口腔医学杂志，2002，18(5)：327-329.
[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.第一增补本[M].北京：中国医药科技出版社，2010：20.
[5] 郑文杰，杨芳，曾鑫华.胆红素的结构、发光与配位化学[J].暨南大学学报，2000，21(5)：57-64.
[6] 方建国，王文清，蒋平，等.反相高效液相色谱法测定体外培育牛黄中胆红素的含量[J].医药导报，2006，25(7)：694-695.
[7] PENG C，TIAN J，LV M，et al.Development and validation of a sensitive LC-MS-MS method for the simultaneous determination of multicomponent contents in artificial Calculus bovis[J].J Chromatographic Sci，2014，52(2)：128-136.。