发酵工程第五章 种子扩大培养

• ④酶活力高。（因为菌丝体密度大） • ⑤对于固体培养，通常用于固体发酵，由于产物 浓度大，易于分离，可以有效的降低产品分离成 本。
• 缺点：
• （1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自 动化生产。 • （2）容易污染其他霉菌。 • （2）周期长。 • （3）培养过程中环境条件控制较难。
2、液体培养 • 培养基配制成液体，接种培养。
第五节 种子制备过程举例
一、谷氨酸生产的种子制备 制备过程 斜面菌种
→一级种子培养
→二级种子培养
→发酵
1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2
培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细 生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
• 种子移种方法 孢子悬浮液采用微孔接种法；摇瓶菌丝 体种子可在火焰接种或差压法；种子罐之 间或发酵罐间接种采用差压法
第四节 影响种子质量的因素
一、种子质量标准
发酵工业生产上常用的种子质量标准，大致有 如下几个方面：
• • • • •
细胞或菌体 生化指标 产物生成量 酶活力 此外，种子应确保无任何杂菌污染
二、影响种子质量的因素
（一）影响孢子质量的因素
（二）影响种子质量的因素
（一）影响孢子质量的因素 培养基
培养条件
培养时间和冷藏时间 种龄 接种量
（二）影响种子质量的因素 培养基
培养条件
种龄 接种量
• 种龄：种龄(seed age)指种子罐中培养的种子开始 移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 • 适宜时间：以菌体处于生命力极为旺盛的对数 生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时， 较为适宜。 • 接种量：接种量(seed volume)是指移入的种子的 体积和接种后培养液的体积比。 • 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁 殖速度。
• 两类：静止培养和通气培养。静止培养适于厌 氧培养；通气培养适于需氧培养。
• 通气培养，实验室阶段利用摇瓶培养。 • 特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求 以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培 养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。
• 优点
• （1）生产效率高，便于自动化管理。 • （2）生产过程中温度、溶氧、pH值等参数可以 实现全面控制。 • （3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。
• 确保无染菌 染菌检测有那些方法？
显微镜检查法 肉汤培养法
平板（双碟）培养法
种子液进行生化分析
三、种子异常的分析
• ⑴菌种生长发育缓慢或过快：菌种老化、 培养基不合适、接种量少、染菌易过慢； 培养基含氮量高，接种量过大，菌体生长 快。 • ⑵菌丝结团：搅拌效果不佳、染菌、接种 量少 • ⑶菌丝粘壁：搅拌效果不佳
思考：固体培养和液体培养的优缺点？
液体培养
• 优点
• （1）生产效率高，便于自动化管理。 • （2）生产过程中温度、溶氧、pH值等参数可以实现全面 控制。 • （3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。
• 缺点：
• （1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。 • （2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产密 度大而难以实现。
• 缺点：
• （1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。 • （2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、 生产密度大而难以实现。 •
第三节 种子扩大培养工艺
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇 床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都 在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实 验室阶段的种子培养。 生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工 程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程 为生产车间阶段。
3、一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 培养条件：27℃，40小时 接种量：200亿孢子/吨
目的：长菌体
4、二级种子 培养基：同上 培养条件：27℃、10-14小时 接种量：10%
种子的质量要求 菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 Ⅲ—Ⅳ期 青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青 期，4-6期合成青霉素的能力最强
• 培养基原料：小麦麸皮、大米、小米 • 过程：上述原料和水混合→灭菌→冷却→ 接种
• 固体培养具有以下优点： • ①原料廉价：以谷物和农业废物为主要原料，只 需外加适量水分、无机盐等。培养基组成简单。 • ②防止污染：利用霉菌能在水分较低的基质表面 进行增殖的特性，在这种条件下，细菌生长不好， 因此不易引起细菌污染。 • ③通气：在固体培养中，氧气是由基质粒子间空 隙的空气直接供给微生物，比液体培养时的用通 气搅拌供给氧气节能。
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
种子的质量要求：
108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列
PH 7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2
活力旺盛
二、青霉素生产的种子制备 制备过程 安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子 → 二级种子 → 发酵
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培 养12小时。 培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基
3. 二级种子(种子罐) 培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5%
End
Thanks!
种子扩培的目的
菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的
投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。
种子的要求：
不但要得到纯而壮的培养物，还要获得活力旺盛的、
接种数量足够的培养物。
第二节 种子培养的方法
1、固体培养 • 固体培养又分为浅盘固体培养和深层固 体培养，统称曲法培养。它起源于我国 酿造生产特有的传统制曲技术。其最大 特点是固体曲的酶活力高。
１、实验室种子制备
• 放线菌、霉菌、芽孢杆菌、孢子制备采用 何种培养方法？ 固体培养 • 不产孢子、产孢子弱的细菌菌体制备采用 何种方法？ 液体培养
例子
卡氏罐：制备酵母种子
２、生产车间种子制备
• 实验室制备孢子或摇瓶培养细胞种子经种 子罐扩大培养，满足种子罐需要。 • 种子罐种子培养
• • • • 一级种子→二级发酵 二级种子→三级发酵 三级种子→四级发酵 种子罐的级数主要决定于菌种的性质和菌体生 长速度及发酵设备的合理应用。在满足种子罐 需要前提下，种子级数越低越好。
第五章 种子扩大培养
发酵的一般流程
培养基Байду номын сангаас制
种子扩大培养 空气除菌 发酵设备
培养基灭菌
发酵生产
下游处理
第一节 种子扩大培养的目的与任务
一、种子扩大培养的概念:
种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥 管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后， 再经过三角瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终 获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养 物称为种子。
→ 一级种子
一、斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等
培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
二、大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆）
培养条件：25℃、7天，控制湿度
培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和 氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有 利于孢子的生长。 大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子
• 思考：固体培养和液体培养的优缺点？
思考：固体培养和液体培养的优缺点？
固体培养
• 优点
• （1）酶活力高。（因为菌丝体密度大） • （2）生产过程中无菌程度要求不是很严格。 • （3）对于固体培养，通常用于固体发酵，由于产物浓度 大，易于分离，可以有效的降低产品分离成本。
• 缺点：
• （1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。 • （2）周期长。 • （3）培养过程中环境条件控制较难。