Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定及penton基因序列分析

Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定及penton 基因序列分析
王彩先，陆冰洋*，刘华栋，李婷婷，唐娟，丁树荣（山西农业大学动物医学学院太原030032
）
查山西省Ⅰ群禽腺病毒感染状况，2018—2020年从山西各地区鸡场采集样品204份，通过SPF 鸡胚传代增殖，设计检测引物及penton 基因全序列引物，经PCR 鉴定，选取阳性毒株进行免疫琼脂扩散试验、致细胞病变和鸡胚致病性试验。

结果显示：60份为Ⅰ群禽腺病毒阳性，阳性率为29.4%（60/204），从60份阳性Ⅰ群禽腺病毒中选取8株病毒与Ⅰ群禽腺病毒阳性血清反应，均呈现阳性；并且都可以导致鸡胚肝细胞发生形态变化，增强其折光性；鸡胚试验可致鸡胚发育不良或致死，有明显病变发生。

将克隆的8株penton 基因进行序列分析比对及遗传进化分析，显示与Ⅰ群禽腺病毒血清1型和血清4型亲缘关系最近，同源性高达99.6%～100%，其中6株为血清1型，2株为血清4型；与Ⅰ群禽腺病毒其它血清型同源性达72.0%～75.8%，与Ⅱ群禽腺病毒和Ⅲ群禽腺病毒同源性为49.0%～52.8%。

研究提示，Ⅰ群禽腺病毒普遍存在于养殖群体中，应当加强对Ⅰ群禽腺病毒的检测和免疫，防治其它传染病的继发感染，以提高动物生产
的安全。

群禽腺病毒；分离鉴定；penton 基因
禽腺病毒（fowl adenovirus ，FAdV ）归属于腺病毒科腺病毒属，Ⅰ群禽腺病毒为线状双链DNA 病毒[1-3]，具有共同的抗原，禽腺病毒颗粒呈球形，具有12个定点，直径为70～90nm ，无囊膜，呈20面体对称结构，由纤突（faber ）、芯髓（cora ）、衣壳（capsid ）及相关蛋白构成表面的252个壳粒，壳粒可以分成六邻体（hexon ）、五邻体（penton ），每个五邻体连接两根纤毛（fiber-1、fiber-2）[4-9]。

其中penton 所在的头节区能够识别细胞表面的病毒受体，在病毒入侵细胞的过程中起着非常重要的作用[10]。

Ⅰ群禽腺病毒包括
传统的禽腺病毒及其他禽类分离物，可以水平传播、垂直传播、污染鸡胚。

该病多数呈隐性感染，在动物体内复制不发病，当动物抵抗力降低时随同其他疾病共同发病，且影响动物免疫功能。

近年出现其他Ⅰ群禽腺病毒具有强致病性，死亡率可达60%[11-13]。

本试验对采集样品进行免疫琼脂扩散试验、血凝试验、致细胞病变和鸡胚致病性试验及PCR 检测，对病毒penton 基因序列进行分析比对。

根据该基因建立起来的PCR 诊断方法可用于Ⅰ群禽腺病毒的鉴定。

1材料与方法
1.1材料及试验动物
SPF 鸡胚，购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，雏鸡均由SPF 鸡胚孵化；Ⅰ群禽腺病毒、减蛋综合征（EDSV ）、新城疫病毒（NDV ）、禽传染性支气管炎病毒（IBV ）、禽流感H9亚型（AIV-H9）、禽传染性喉气管炎病毒（ILTV ）阳性血清和SPF 鸡阴性
血清由山西农业大学动物医学学院提供。

1.2主要试剂
E.coli DH5α菌株、病毒基因组DNA 抽提试剂盒、PCR 产物纯化回收试剂盒、DMEM 、胎牛血清，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；pMD18-T 克隆载体、Premix Taq ，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3病毒的分离
取采集样品，60Hz 、10min 研磨，反复冻融3次后，6,000r/min 离心5min ，取上清液过0.22μm 滤菌器。

采用尿囊腔接种法接种于9～10日龄SPF 鸡胚，每枚SPF 鸡胚接种200μL ，弃24h 内死亡鸡胚，温育120h ，将全部SPF 鸡胚放入4℃、6h ，收获尿囊液，连续3次传代后收集的尿囊液用于DNA 提取，提取方法参照病毒基因组DNA 提取试剂盒说明书进行。

1.4引物设计
根据GeneBank 公布的FAdV-4中hexon 和penton 基因序列[14,15]，
设计hexon 检测引物，分别是text-F/text-R ，预期片段大小为421bp ；设计penton 的测序引物，分别是pen-ton-1F/penton-1R ，预期片段大小为1,834bp ，penton-4F/pen-ton-4R ，预期片段大小为1,759bp ，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.5样品PCR 检测
PCR 扩增体系（总体积为25μL ）：Premix Taq 20μL ，DNA 模板3μL ，text-F/text-R 各1μL 。

PCR 扩增程序：95℃预变性10min ；95℃变性30s ，56℃退火30s ，72℃延伸30s ，共30个循环；
72℃再延伸10min 。

取5μL PCR 反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6penton 基因的克隆
1.5中PCR 检测为禽腺病毒阳性的毒株中，选取8株进行PCR ，扩增体系（总体积为25μL ）：Premix Taq 20μL ，DNA 模板3μL ，上下游引物各1μL 。

PCR 扩增程序：95℃预变性10min ；95℃
基金项目：山西省农业科学院农业科技创新研究课题—山西农谷研发专项（YCX2018208）；山西省农业科学院农业科技创新研究课题-优秀青年基金项目（YCX2020YQ21）
作者简介：王彩先（1962—），女，本科，副研究员，研究方向为畜禽安全养殖技术，****************。

*通信作者：陆冰洋（1982—），硕士，副研究员，研究方向为家禽传染病及病毒学，**********************。

doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2021.01.075
表1 FAdV-4 penton 基因引物序列信息551834变性 30s ，55℃/56℃退火 30s ，72℃延伸 30s ，共 30 个循环；72℃再延伸 10min 。

取 5μ L PCR 反应产物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

PCR 产物经胶回收，将胶回收产物连接 pMD18-T 克隆载体，将连接产物转化入大肠杆菌DH 5α ，经 37℃培养 24h 后，挑取单菌落，经 PCR 鉴定，阳性菌送北京六合华大基因科技有限公司进行基因测序，测序结果使用 DNAstar 进行序列比对，并构建进化树。

1.7 免疫琼脂扩散试验
经 1.5 中 PCR 鉴定为阳性的禽腺病毒毒株中，选取8 株不同年份的禽腺病毒毒株，制备抗原，按照常规方法进行琼脂扩散试验，用Ⅰ群禽腺病毒阳性血清与 8 株禽腺病毒抗原互相作用，Ⅰ群禽腺病毒阳性血清与减蛋综合征（EDSV ）、新城疫病毒（NDV ）、禽传染性支气管炎病毒（IBV ）、禽流感 H9 亚型（AIV-H9）、禽传染性喉气管炎病毒
（ILTV ）阳性血清和 SPF 鸡阴性血清互相作用为对照1.8SPF 鸡胚肝细胞制备及病变
按照制备原代鸡胚肝细胞方法将 15～16d SPF 鸡胚的肝组织用 0.25%胰酶消化，以含10%胎牛血清的DMEM 作为培养基，放置在 CO 2 培养箱中以 37℃，5%CO 2 培
养，经培养长成至单层后，取 2mL 分离上清液接种 SPF 鸡胚肝细胞，
经2h 感染后弃去分离物，加入 20mL 5%胎牛血清维持液，同时设置未接种分离物SPF 鸡胚肝细胞为阴性对照， 12h 后观察培养情况，以后每3h 观察一次。

1.9 鸡胚致病性试验
8株禽腺病毒分离物上清液分别接种9～10d SPF 鸡胚48枚，每株6枚，每枚SPF 鸡胚接种200μL 设置空白对照6枚。

37℃孵育培养，分别于72h 、96h 、120h 观察鸡胚的生长情况和病变情况。

2结果与分析
2.1样品PCR 检测
经病毒基因组DNA 提取试剂盒提取盲传3代增殖尿囊液的DNA ，经PCR 鉴定，在204份样品中，60份为Ⅰ群禽腺病毒阳性，阳性率为29.4%（60/204），部分样品的PCR 结果见图1。

2.2penton 基因的克隆
分别以8株阳性禽腺病毒上清液提取的DNA 为模板进行PCR 扩增，均能扩增出1,736bp 片段，与预期目标相符，阴性对照pMD-18T 载体质粒中未能扩增出目标条带，PCR 结果见图2。

2.3penton 基因的序列比较和进化树分析
使用DNAStar 软件对8株1,759bp 的penton 基因序列进行分析。

其中FAV-01和FAV-03与Ⅰ群禽腺病毒血清4型同源性分别为100%与99.8%，其余6株阳性禽腺病毒毒株与Ⅰ群禽腺病毒血清1
型同源性为99.6%～99.9%，
所有的8株阳性禽腺病毒毒株与Ⅰ群禽腺病毒其他血清型同源性为72.0%～75.8%，与Ⅱ群禽腺病毒HEV （Turkey adenovirus 3strain CA-AB ）的同源性为49.0%～50.4%，与Ⅲ群禽腺病毒EDSV （Duck adenovirus 1strain D11-JW-012）的同源性为50.9%～52.8%，见图3。

遗传进化树分析显示，FAV-01与FAV-03与Ⅰ群禽腺病毒血清4型亲缘关系最近，其余6株阳性禽腺病毒毒株与Ⅰ群禽腺病毒血清1型亲缘关系最近，所有的8株阳性禽腺病毒毒株与Ⅰ群禽腺病毒其他血清型亲缘关系相对较远，与Ⅱ群禽腺病毒HEV 和Ⅲ群禽腺病毒EDSV 属于不同进化分支，亲缘关系最远，见图4。

2.4琼脂扩散试验结果
8株阳性禽腺病毒上清液与Ⅰ群禽腺病毒阳性血清均出现特异性白色沉淀带，而减蛋综合征（
EDSV ）、新城疫病毒（NDV ）、禽传染性支气管炎病毒（IBV ）、禽流感H9亚型（AIV-H9）、
禽传染性喉气管炎病毒（ILTV ）阳性血清和SPF 鸡阴性血清均不能与Ⅰ群禽腺病
M.DL-2000Marker ；1-15.样品。

图1样品PCR 扩增结果
M.DL-2000Marker ；1-8.阳性禽腺病毒毒株；9.pMD-18T 阴性对照
图2阳性禽腺病毒毒株PCR 扩增结果
科研动态
毒阳性血清产生特异性白色沉淀带。

2.5细胞病变结果
8株阳性禽腺病毒上清液接种SPF 鸡胚肝细胞，鸡胚肝细胞12h 后逐渐开始出现变圆、皱缩，24h 后集聚成堆、脱落、遮光性增强、细胞间距增大，呈拉网状结构的病变特征；而对照组的鸡胚肝细胞无相似病变特征。

2.6鸡胚致病性试验
8株阳性禽腺病毒上清液接种SPF 鸡胚后72h 无死亡产生，每株禽腺病毒4℃冷冻2枚，共计16枚可观察到全部SPF 鸡胚均出现尿囊液浑浊，有大量尿酸盐产生，部分胚胎发育不良，呈侏儒胚，有出血症状，肝脏无明显病变，绒毛尿囊膜增厚，阴性对照胚体发育正常无病变；96h 后无死亡产生，每株禽腺病毒4℃冷冻2枚，共计16枚，病变情况与72h 相似，出血鸡胚组织松软，取出时容易
撕开断裂；120h 有1枚SPF 鸡胚死亡，观察剩余16枚鸡胚，病变情况与72h 相似，死亡鸡胚出现溶解样病变，肝脏呈土黄色无出血点。

各阶段对照组SPF 鸡胚均发育正常。

3讨论
Ⅰ群禽腺病毒对禽类的致病性主要引起的疾病有心包积液综合征（HPS ）和包涵体肝炎
（IBH ）
[16,17]
，本试验从采集的204份样品中，经SPF 鸡胚传代增殖及PCR 鉴定，确定60份样品为Ⅰ群禽腺病毒阳性，阳性率为
29.4%（60/204），可见Ⅰ群禽腺病毒普遍存在于健康鸡群中，呈
现感染率较高，并且发病率低于感染率。

Ⅰ群禽腺病毒感染鸡群通常没有明显的临床症状，并且可以垂直传播。

但是根据Ⅰ群禽腺病毒毒力的不同也可引起包肝炎和心包积液综合征，主要临床表现为心包腔内充满大量黄色透明液体或胶胨状物质，肝脏肿大出血，脾脏肿大出血，肾脏肿大出血伴有尿酸盐沉积，腺胃和肌胃交界出血，偶有肺脏出血发生。

由于Ⅰ群禽腺病毒普遍存在于健康禽类之中[18]，如鸡、鸭、鹅等，却不表现明显的致病特征和临床症状，极易在养殖生产中被忽略，由于该病垂直传播，隐性污染鸡胚的可能性被提高，加之部分生物制品中仍无法完全使用SPF 鸡胚或者是免疫鸡胚，在生产过程中依赖非免疫鸡胚，使得Ⅰ群禽腺病毒污染生物制品的情况发生，严重影响胚源生物制品的质量。

8株阳性Ⅰ群禽腺病毒毒株经序列同源性比较和进化树分析，
图38株阳性Ⅰ群禽腺病毒毒株同源性
分析
图48株阳性Ⅰ群禽腺病毒毒株进化树
分析
Microbiology,2021,336.
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penton基因与已报道的Ⅰ群禽腺病毒血清1型和血清4型序列同源性达99.6%～100%，与其他Ⅰ群禽腺病毒血清型同源性达72.0%～75.8%，与Ⅱ群禽腺病毒HEV同源性为49.0%～50.4%，与Ⅲ群禽腺病毒EDSV同源性为50.9%～52.8%；进化树分析确定8株阳性毒株其中6株阳性与Ⅰ群禽腺病毒血清1型接近，2株阳性与血清4型接近，8株阳性与Ⅰ群禽腺病毒其他血清型较远，而与Ⅱ群禽腺病毒和Ⅲ群禽腺病毒亲缘关系最远，属于不同的进化支，表明8株阳性毒株均归属于Ⅰ群禽腺病毒。

Ⅰ群禽腺病毒虽然只有少数血清型能够引起明显发病，但当鸡群受到其他禽类传染病的侵害时可以产生协同作用，如鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）和鸡传染性贫血病毒（CIAV）[19-21]，可使条件性致病源发生快速感染，导致免疫系统受到侵害，引起产蛋下降、再生障碍性贫血和死亡等症状，应当对Ⅰ群禽腺病毒予以重视，防止大规模疾病发生。

4结论
本试验分离到60株FAV，多数阳性毒株采集于无症状鸡群，表明FAV在鸡群中呈阴性感染状态，应当采取血清学检测或者是分子生物学检测，以指导鸡场采用疫苗或者淘汰的方法进行净化，经PCR鉴定及序列测定毒株仍未有更详尽的研究，将会对其进行更深入的探讨。

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