新冠核酸检测结果分析、报告与解释(新冠肺炎核酸检测学习专家课堂)

20200427第8批内标基因扩增结果
20200427第8批阳性质控品
20200427第8批弱阳性质控品 （卫健委提供，不带内标）
20200427第8批试剂空白
20200427第8批阴性质控品
0424第2批临床样本内标弱阳性，复查
20200713第6批 H8内标未扩增， 复查
20200420第2批内标基因结果 试剂空白和弱阳性质控品内标污染
使病毒形如王冠状 其基因组大约由29000个核苷酸组成 其基因组序列与蝙蝠SARS样冠状病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-
CoVZXC21株序列同源性85%以上，S刺突蛋白含SARS-CoV相似的受体 结合结构域 与2003年引起SARS的SARS-CoV同源性79.5% 采用β-CoV基因组中一个互补回文序列进行分析，发现SARS-CoV-2可能 来自菊头蝠（Rhinolophus）
SARS-CoV-2的基因组结构特点
SARS-CoV-2基因组有12个开放读码框（ORF），包括1ab、S、3、E、M、7、 8、9、10b、N、13、14
ORF 1ab为RNA依赖的RNA聚合酶基因（RdRp）所在区域，编码RNA聚合酶， 负
责病毒核酸复制
S区编码刺突蛋白，与病毒感染能力相关，通过与细胞表面血管紧张素转换酶2受 体结合进入宿主细胞
患者体内病毒载量低，样本中的病毒量达不到试剂的最低检测限 所使用的病毒核酸检测试剂灵敏度不够高 实验室未严格遵循临床基因扩增检验的质量管理，如样本灭活以后未
及时进行核酸提取、核酸提取程序未用标准程序等 样本的质量问题，是否规范采集、是否采集到含病毒的细胞 病毒在流行过程中发生基因突变，可能导致假阴性 与疾病进程有关，疾病不同阶段不同检测样本的阳性率不同
设置探针检测模式：Reporter1：FAM（N基因），Quencher 1：NONE； Reporter 2：VIC（ORF1ab基因），Quencher 2：NONE； Reporter3： Cy5（内标基因），Quencher3：NONE；Passive Reference：NONE
设置样本检测位置：打开“Setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控品 （NTC）、阳性质控品以及未知样本（Unknown），并在“Sample Name”一栏中设置样本号
外膜有蘑菇状蛋白刺突使病毒形如王冠状其基因组大约由29000个核苷酸组成其基因组序列不蝙蝠sars样冠状病毒batslcovzc45呾batslcovzxc21株序列同源性85以上s刺突蛋白含sarscov相似的受体结合结构域不2003年引起sars的sarscov同源性795采用cov基因组中一个互补回文序列进行分析发现sarscov2可能来自菊头蝠rhinolophussarscov2的基因组结构特点sarscov2基因组有12个开放读码框orf包括1abs3em78910bn1314orf1ab为rna依赖的rna聚合酶基因rdrp所在区域编码rna聚合酶责病毒核酸复制s区编码刺突蛋白不病毒感染能力相关通过不细胞表面血管紧张素转换酶2受体结合进入宿主细胞e区编码囊膜蛋白负责病毒包膜及病毒颗粒的形成m区编码膜蛋白n区编码核壳蛋白不病毒基因组宿主rna互相识别由于sarscov2的1ab基因区的rdrp基因在进化树上不sarscov的rdrp基因显著丌同故被列为一种全新的属冠状病毒
设置扩增条件：打开“instrument”窗口，根据试剂盒说明书设置循环条件
PCR循环条件的设置
设置完成后，保存文件（年月日+项目+批次），运行程序。
扩增结果分析流程
扩增结束后保存结果 将原始扩增曲线由对数图谱转换为线性图谱，对每个检测基因
（ORF1ab、N、内标）分别进行分析，分别调节其基线和阈值，点 击Analysis获得分析结果 先分析质控样本结果，再分析临床样本结果 应分析每个样本的所有扩增曲线 在“Report”窗口读取检测结果
检测结果与检测试剂的灵敏度有关
病毒在流行过程中发生基因突变，可能导致假阴性结果
ห้องสมุดไป่ตู้
谢谢!
2的重要标志物。
SARS-CoV-2的核酸检测方法
实时荧光逆转录PCR法（qRT-PCR）：目前最常用的实验室诊 断SARSCoV-2感染的方法（17个）
恒温扩增：即时检测（POCT）（4个） 基因测序：将测序结果与已知的SARS-CoV-2序列做同源性比对（1个） 杂交捕获法：1个 已有23个获NMPA批准的新冠核酸检测试剂（截至7.13）
靶基因和内标均无扩增曲线，进行复检。 阳性样本采用第二种试剂复检，或用灵敏度更高的试剂或方法复检。
基线（baseline）：产物积累的荧光信号能被仪器检测到的最下限。
循环阈值(cycle threshold, CT)
20200427第8批N基因扩增结果
20200427第8批ORF1ab基因扩增结果
E区编码囊膜蛋白，负责病毒包膜及病毒颗粒的形成
M区编码膜蛋白
N区编码核壳蛋白，与病毒基因组宿主RNA互相识别
由于SARS-CoV-2的1ab基因区的RdRp基因在进化树上与SARS-CoV的RdRp基 因显著 不同，故被列为一种全新的β属冠状病毒。因此，RdRp基因也成为鉴定 SARS-CoV-
报告中应有以下基本信息： 患者姓名、性别、年龄、标 本类型、诊疗卡号、条码号、 科别、床号、检测方法、标 本接收时间、报告时间、检 测者和审核者签名等。
结果解释
报告方式：阴性/阳性或检出/未检出，应统一 阴性或未检出的解释：患者没有感染新冠病毒或检测样本中的病
毒载量低于试剂检测限 阳性的解释：患者感染了新型冠状病毒 临床高度怀疑新冠病毒感染而检测结果阴性时，建议重新采集或
20200427第13批内标基因结果 弱阳性质控品内标污染
20200425第1批阳性质控品结果（右图） 靶标基因Ct值降低3~4，内标基因Ct值大于40，阳性质控品失控
20200708试剂空白的扩增曲线
N基因结果
ORF1ab结果
全国第二次室间质评N、 ORF1ab和内标结果
内标结果
结果报告
2020.2.11.WHO将SARS-CoV-2引起的疾病称为2019冠状病 毒病（coronavirus disease 19, COVID-19）
SARS-CoV-2的病原学特点
SARS-CoV-2是新发现的可感染人类的冠状病毒 属于套式病毒目、冠状病毒科、β-冠状病毒属 为单股正链有包膜的RNA病毒 呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60~140nm。外膜有蘑菇状蛋白刺突，
更换部位采集样本重测 应避免报告不规范，如病毒名称写为COVID-19 阳性结果应在12h内进行传染病上报和后续流行病学调查工作
报告时限
发热门诊、急诊 患者
普通门诊、住院 患者和陪护人员
愿检尽检人群
• 6小时内
• 12小时内
• 24小时内
临床假阴性问题
即临床高度疑似COVID-19（临床症状和影像学支持），而新冠 核酸检测结果多次或始终阴性。其原因如下：
结果判断标准
阳性判断标准：ORF1ab和N基因Ct值≤40，且有明显的S型扩增曲线 阴性判断标准：ORF1ab和N基因无扩增曲线或Ct值＞40，且内对照
有扩增曲线
可疑判断标准：ORF1ab和N区，仅有其中一个Ct值≤40，且有明显的 S型扩增曲线
复检规则：
对于检测结果可疑的样本，进行复检。若复检结果一致，判断样品为新型 冠状病毒阳性；若复检均为阴性，判断为未检测到新型冠状病毒RNA。
核酸提取和扩增：根据所用试剂的说明书操作。样本保存液、核酸提取
试剂应与核酸扩增试剂配套。有些核酸提取试剂易受胍盐或保存液中特殊成
分的影响，影响核酸提取效果。
质控样本：试剂空白、阴性、弱阳性、阳性质控样本
扩增仪参数设置
以ABI Prism 7500和达安基因股份有限公司双靶标检测试剂为例
在荧光定量PCR仪上设置参数：
新冠核酸检测结果分析、 报告与解释
新型冠状病毒
2020.1.12.WHO将2019年底新发现的冠状病毒暂时命名为新 型冠状病毒（2019 novel coronavirus, 2019-nCoV）
2020.2.11.国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组将新型冠 状病毒正式命名为严重急性呼吸道综合征冠状病毒2（sever acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）
qRT-PCR法检测SARS-CoV-2
检测原理：根据SARS-CoV-2基因序列设计引物和TaqMan探针，采 用实时逆转录多重RT-PCR法扩增SARS-CoV-2基因和内标基因（常 用RNase P基因，非竞争性内标），定性检测样本是否存在SARSCoV-2。
靶标基因：1、2、3个不等，常为2个靶标。
实验室检测的假阴性
所采集样本中病毒载量高于所用检测试剂的检测限，而实验室确 没有检出。
需要实验室严格遵循临床基因扩增检验的质量管理，尽量避免。
检测方法的局限性
样本检测结果与样本采集、处理、运送及保存质量有关，不合理 的样本采集、转运、储存及处理过程均可能导致错误的检测结果
样本处理时应严格按操作规程操作，否则可能出现假阳性或假阴 性结果