口腔鳞癌miR-762的表达及其与癌细胞增殖和转移的关系

・18・现代医芳
Modem Medical Journal
2021,Jan；49(l):18-23
.论著.
口腔鳞癌miR・762的表达及其与癌细胞增殖
和转移的关系
麦明思，赵炭，马错
(三亚市人民医院口腔科，海南三亚572000)
［摘要］目的：检测口腔鳞癌微小RNA-762(miR-762)的表达，探讨其与癌细胞增殖和转移的相关性。

方法：收集确诊为口腔鳞癌的患者共62例。

肿瘤组织作为观察组，距肿物边缘大于2cm的正常口腔黏膜组织作为对照组。

应用实时荧光定量PCR法检测两组中miR-762的表达，并采用免疫组化法和Western blotting法检测观察组中Ki67、MMP-2和MMP-9的表达。

结果：观察组miR-762的表达水平明显高于对照组。

观察组miR-762的表达在有无脉管累犯、有无淋巴结转移和不同TNM分期间差异均有统计学意义，而在不同性别、年龄和分化程度间差异均无统计学意义。

miR-762的表达与生存时间密切相关。

相关分析显示,miR-762的表达与肿瘤的最大径、Ki67增殖指数、MMP-2和MMP-9的表达均呈正相关。

结论：口腔鳞癌miR-762的表达升高，与病变的形成和进展有关。

miR-762对癌细胞增殖有明显的促进作用，对癌细胞转移的调节可能是通过介导MMP-2和MM-9实现的。

检测miR-762的表达可预测口腔鳞癌的预后。

［关键词］口腔鳞癌；微小RNA-762；增殖；凋亡；预后
［中图分类号］R739.85［文献标识码］A［文章编号］1671-7562(2021)01-0018-06
doi：10.3969/j.issn.1671-7562.2021.01.004
Expression of miR-762and its relationship with proliferation and
metastasis in oral squamous cell carcinoma
MAI Mingsi,ZHAO Yan,MA Kai
(Department of Stomatology,Sanya People's Hospital,Sanya572(XX),China)
［Abstract］Objective:To detect the expression of microRNA-762(miR-762)in oral squamous cell carcinoma, and to explore its relationship with cell proliferation and metastasis.Methods:62patients with oral squamous cell carcinoma were collected.Tumor tissues were selected as observation group,normal oral mucosa tissues(>2cm from the edge of the tumors)were selected as control group.miR-762was detected by real-time fluorescence quantitative PCR in the two groups.Ki67,MMP-2and MMP-9were detected by inimunohistochemical method in observation group.Ki67,MMP-2and MMP-9were detected by Western blotting method in observation group. Results:The expression of miR-762was significantly higher in observation group than that in control group.The expression of miR-762was statistically significant in different vascular recidivism,lymph node metastasis and different TNM stages,but was not statistically significant in gender,age and differentiation in the observation
［收稿日期］2019-07-05［修回日期］2020-10-03
［基金项目］海南省自然科学基金资助项目(814390)
［作者简介］麦明思(1982-),男，海南三亚人，主治医师。

E-mail：54323**********
［通信作者］赵叙E-mail：zhaoyan840116@
［引文格式］麦明思，赵燄，马错.口腔鳞癌miR-762的表达及其与癌细胞增殖和转移的关系［J］.现代医学,2021,49(1)：18-23.
麦明思，等.口腔鳞癌miR-762的表达及其与癌细胞增殖和转移的关系・19・
group.The expression of miR-762was closely related to survival time.Positive correlation was found between miR-762and maximum diameter,miR-762and Ki67proliferation index,miR-762and MMP-2expression,miR-762 and MMP-9expression.Conclusion:The increased expression of miR-762is related to the formation and progression in oral squamous cell carcinoma.Expression of miR-762can promote cell proliferation.The metastasis regulation of miR-762may be mediated by MMP-2and MM~9.Expression of miR-762may be related to prognosis. [Key words]oral squamous cell carcinoma；microRNA-762；proliferation；apoptosis；prognosis
口腔癌中鳞癌最常见，肿瘤细胞的侵袭性强,患者预后差o microRNA（miRNA）在肿瘤的形成和进展中有明显作用。

miRNA是由17~25个碱基组成的单链RNA分子，广泛存在机体内，在不同肿瘤中的作用也不同。

miRNA通过调控其基因功能参与鳞癌的形成和进展⑶。

miR-762被认为是与肿瘤形成有关的因子，其主要促进上皮细胞的恶性转变⑷。

本研究针对筛选出的miR-762在口腔鳞癌中的表达进行研究，观察其在不同临床病理特征中的表达差异，关注miR-762对细胞增殖相关蛋白Ki67的影响，探讨其与转移相关因子MMP-2和MMP-9的关系。

1资料和方法
1.1一般资料
选择本院2014年1月至6月确诊为口腔鳞癌并行根治术的62例患者作为研究对象。

选取术后标本中的肿瘤组织作为观察组，距肿物边缘大于2cm的正常口腔黏膜组织作为对照组。

均留取术后的新鲜组织（-80°C冻存）及石蜡包埋组织。

本研究经医院伦理委员会批准,患者或家属签署研究知情同意书。

1.2预后资料
根据患者住院期间的存档电话对62例患者进行电话随访，截至2019年6月，术后随访时间为8~60个月。

存活时间定义为手术当天至最后随访调查的时间或患者去世的时间。

随访健在的患者按删截样本处理。

1.3样本量的评估
应用两样本均数比较的评估方法，即“I=“2= 2[（"«+u^/8/a}1+l/4u a2。

据以往经验及查阅文献,正常组织中的相对表达约为0.9,肿瘤组织中的相对表达量约为1.1,两者的差值是0.2,如果¢=0.2, 8/ct=1,a取双侧0.05,计算n}=n2«59例。

估计5%的失访率，则所需样本约为62例。

1.4纳入与排除标准
纳入标准：（1）符合WHO中鳞癌的病理诊断标准,并经病理医师复诊；（2）原发病变；（3）术前未行放、化疗。

排除标准：（1）多原发癌；（2）既往有口腔手术史；（3）伴有遗传疾病。

1•5方法
1.5.1两组miR-762的检测选择U6作为内参。

应用新鲜冻存组织进行miR-762的检测。

miR-762引物上游为5'-CTCACTGGGGGACTCTCAAGGCTG-3',下游为5，-ACAACCTTGGGACTACGCTT-3，。

应用实时荧光定量PCR法检测组织中miR-762的表达。

严格按说明书进行操作，PCR反应程序如下：95°C5min；95°C25s,64°C20s,72°C20s,15个循环；93T 25s,60°C35s,72°C20s,35个循环。

在60七时收集信号，执行实时PCR。

记录Ct值，通过2"也法计算目的基因的相对表达水平。

AACt=[Ct HWMH（未知样品）-Ct对照（未知样品）]-[Ct lwsw（校正样品）-校正样品）]。

1.5.2免疫组化方法检测观察组Ki67、MMP-2和MMP-9的表达对观察组标本常规取材、脱水、石蜡包埋后，切取4“m切片，应用免疫组化二步法进行实验。

Ki67、MMP-2和MMP-9试剂购自北京中杉金桥生物技术公司。

先进行预实验，选择Ki67为1:100、MMP-2为1:250、MMP-9为1：100的水平用于正式实验，行DAB显色。

按说明书进行实验，做好质控工作。

结果由病理医师盲法评定。

Ki67染色部位是细胞核，选择3个400倍视野进行计数，取平均值作为增殖指数。

MMP-2和MMP-9的阳性部位是细胞质和（或）细胞膜，以浅黄到棕褐色定为阳性。

着色强度：以无、浅黄、黄、棕褐色分别计为0、1、2、3分。

选择3个400倍视野进行计数，取阳性率的平均值，以阳性率＜5%为0分,5%~25%为1分,26%~50%为2分，51%-75%为3分，＞75%为4分。

上述分值相加为MMP-2和MMP-9的最终评分，总分0~7分。

1.5.3Western blotting方法检测Ki67、MMP-2和MMP-9的表达应用新鲜冻存标本，严格按实验步骤进行蛋白提取、蛋白浓度测定、蛋白变性、加样、电泳、电转膜、免疫杂交后，取出膜加入超敏发光液，发光时间2min o将膜取出放入X线胶片盒曝光3min,显影20s。

应用Image J软件进行分析，以目的蛋白与
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gapdh灰度的比值作为相对表达量”
1.6统计学处理
应用SAS6.12统计软件进行分析,行卡方检验、t 检验、配对资料的t检验、方差分析(并应用SNK法进行两两比较)，应用Pearson相关分析及生存分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1研究对象的基本特征
本研究对象62例中男31例，女31例；年龄42~ 86岁，平均(61.8±10.9)岁。

其中高分化30例，中分化22例,低分化10例;有淋巴结转移者28例，无淋巴结转移者34例；有脉管累犯者10例，无脉管累犯者52例;TNM分期I+II期者37例，IB+IV期者25例。

2.2两组中miR-762表达的比较
实时荧光定量PCR检测结果显示，观察组miR-762表达相对值为3.01±0.37,明显高于对照组的
1.01±0.23,差异有统计学意义Q=7.01,P=0.001)。

2.3观察组不同临床特征中miR-762表达的比较
观察组miR-762的表达在有无脉管累犯、有无淋巴结转移和不同TNM分期分组中的差异均有统计学意义(P<0.05),而在不同性别、年龄、分化程度分组中的差异均无统计学意义(P>0.05)。

见表1。

2.4miR-762表达的生存分析
本组患者均进行术后60个月的生存随访,术后生存时间为7~60个月，中位生存期为32个月，平均(23.4±4.3)个月。

其中存活17例，死亡42例，失访3例。

生存分析显示,miR-762的表达与生存时间有关(临界值为3.01,P=0.015)o见图1。

2.5观察组miR-762的表达与肿瘤最大直径的相关性
肿瘤最大直径的范围是1.2~8.9cm,平均(4.3士1•1)cm。

相关分析显示,miR-762表达与肿瘤最大直径呈正相关(r=0.48,P=0.0198)。

见图2。

2.6观察组miR-762的表达与Ki67、MMP-2和MMP-9免疫组化结果的相关性分析
相关分析显示，观察组miR-762的表达与Ki67标记的增殖指数(r=0.56,P=0.012l)、MMP-2的表达(,=0.51,P=0.0198),MMP-9的表达(r=0.52,P= 0.0170)均呈正相关。

见图3、4。

2.7观察组miR-762的表达与Ki67、MMP-2和MMP-9的Western blotting结果的相关性分析相关分析显示，观察组miR-762的表达与Ki67(r= 0.62,P=0.0089)、MMP-2(r=0.53,P=0.0115)、MMP-9(r=0.59,P=0.0123)均呈正相关。

见图5、6。

表1观察组不同临床特征分组中miR-762表达的比较
Tab1Comparison of miR-762in different clinical characteristics of observation group
临床特征n miR-762F或<值P值
性别
男31 3.11±0.35
0.950.486
女31 2.91±0.74
年龄
<60岁30 3.19±0.67
0.890.584
M60岁32 2.89±0.60
分化程度
高30 2.82±0.65
中22 3.35±0.58 1.230.214低10 3.36±0.60
TNM分期
I-n期37 2.12±0.43
4.440.023
ID-IV期25 4.02±0.57
淋巴结转移
无34 2.10±0.53
5.540.019
有28 4.28±0.59
脉管累犯
无52 2.58±0.79
6.150.006
有10 5.08±0.55
上曲线为miB-762低表达，下曲线为miR-762高表达
图1miR-762的表达与生存时间的关系
Fig1Relationship between miR-762and survival time
图2miR-762与肿瘤最大径的相关性
Fig2Relationship between miR-762and max
diameter
麦明思，等.口腔鳞癌miR-762的表达及其与癌细胞增殖和转移的关系・21・
A. Ki67的表达(x 100 )
B. MMP-2的表达(x200 )
C. MMP-9的表达(x200 )
图3 Ki67 .MMP-2 .MMP-9的免疫组化检测结果
Fig 3 Results of Ki67, MMP-2, MMP-9 proteins by immunohistochemical method
100n
80-
r d l
6H
4
$
4J 2H
(H -----------F
0 2
4 6
8 ?0
miR-762
4 6miR-762
77
8 ?0
图4 miR-762与Ki67 MMP-2、MMP ・9相关性分析图
Fig 4 Figure of relationship analyse between miR-762 with Ki67 , MMP-2, MMP-9 by immunohistochemion method
Ki67
GAPDH
图 5 Ki67.MMP-2、MMR ・6 的 Western blotting 表达图
Fig 5 Expression of Ki67, MMP-2, MMR-6 by Western blotting method
lO-i
IOi
8i 8 6 4 2
6,d
乏三
01
1
• •
i
0 2
4 6 8
miR-762
)4-0
-T 6
nnR-762
-O
8 6 4 2
2
T
图6 miR-762与Ki67、MMR ・2、MMR-9相关性分析图
Fig 6 Figure relationship analyse between miR-762 with Ki67, MMR-2, MMR-9 by Western blotting
3讨 论
口腔鳞癌的形成与蛋白、基因表达异常有关。

miRNA 在细胞内广泛存在，其能够对染色体和遗传因
素进行有效的调控，也能调节染色质的重塑。

miRNA
是一类长度为22 bp 的内源性非编码RNA,是重要的
转录后调节因子⑸。

近年对miR-762关注得较多，认
为其可以调节肿瘤性病变的形成，尤其是鳞状细胞癌
・22・现代医学(Modern Medical Journal)2021年1月，49(1)
的发生和进展c miR・762的靶基因可能参与肿瘤细胞的正性代谢过程和蛋白质的结合，对肿瘤的进展有明显的促进作用⑹。

miR-762的作用途径和功能可能更多，如在肿瘤中可以提高细胞的增殖能力，显著抑制细胞的凋亡⑺。

本研究用Ki67标记肿瘤细胞的增殖，具有准确性和客观性。

Ki67是临床标记细胞增殖的重要指标之一。

MMP-2和MMP-9是基质金属蛋白酶家族中的重要成员⑻，也称为明胶酶，对IV型胶原、明胶、层粘连蛋白、基底膜和细胞外基质的降解作用强,两者是重要的转移促进因子⑼□
本研究结果显示肿瘤miR-762的表达明显高于癌旁组织，提示miR-762表达升高是促进肿瘤形成的重要因素，miR-762可能是鳞状上皮异型增生、癌变的重要因子。

观察组miR-762的表达在有无脉管累犯、有无淋巴结转移和不同TNM分期中差异有统计学意义以上因素均为肿瘤进展及判断临床生物学行为的重要因素，因此检测到肿瘤组织中miR-762高表达提示肿瘤处于进展状态。

miR-762是转移相关因素的诱导因子。

生存分析显示miR-762的表达与生存时间相关，提示术后检测miK-762的表达可能对判断生存时间有一定价值。

miR-762与肿瘤最大直径的相关性证实了miR-762对肿瘤生长的促进作用，与Ki67增殖指数的相关性证实了miR-762对细胞增殖的影响。

miR-762高表达时引起肿瘤细胞繁殖加快，细胞的体积增大，细胞异型性明显，对局部组织的浸润和侵袭能力增强。

肿瘤细胞的异常增殖，有效地促进肿瘤细胞的分裂再生及异型增生，引起肿瘤生长。

miR-762的表达与MMP-2及MMP-9的表达均呈正相关，提示miR-762对肿瘤迁移的促进作用可能是通过MMP-2和MMP-9实现的。

MMP-2和MMP-9是降解细胞外基质和基底膜的重要物质，可使肿瘤转移的屏障溶解、破坏，使肿瘤细胞易于离开原发灶形成转移灶。

miR-762的作用方式及调节通路可能不仅局限于增殖和迁移.miR-762具有癌基因的作用，其活化后的作用可能对诱导多种通路的激活有关，如通过调节VEGF促进血管新生、通过调节黏附蛋白促进肿瘤细胞的黏附性发生改变〔宓。

miR-762可能是促进上皮间质转化的重要因子。

生物信息学研究结果⑴）显示，miR-762与RAS的3'非翻译区有一个保守的结合位点，推测RAS可能是miR-762的靶基因,miR-762在肿瘤中的作用可能与RAS有关。

李强等通过实验发现miR-762在肿瘤组织和肿瘤细胞株中表达增高，认为miR-762能够增强癌细胞的侵袭迁移能力,miR-762对细胞增殖、上皮间质转化和转移均有调节作用，同时发现抑制miR-762的表达后肿瘤细胞的活性减弱，侵袭能力下降。

本研究结果未显示miR-762的表达与分化的关系，因此miR-762对肿瘤细胞幼稚到成熟过程的影响有待进一步研究。

miR-762还可能是肿瘤形成时的转录调节因子，使肿瘤凋亡受到抑制后细胞出现永生化[13-,4)O miR-762在调节细胞干细胞分化中的作用不大，可能主要还是对细胞分化后增殖和转移的调节作用。

总之，口腔鳞癌miR-762的表达升高与病变的形成和进展有关,miR-762对细胞增殖有明显的促进作用,miR-762对转移的调节可能是通过介导MMP-2和MM-9实现的。

检测miR-762的表达可预测口腔鳞癌的预后。

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•论著・
人类白细胞抗原・E对子宫内膜癌诊断及
预后判断的价值分析
吴世丽-许莉-陈永香2
(海口市妇幼保健院1.妇产科,2.检验科，海南海口570001)
［摘要］目的：分析血清人类白细胞抗原-E(sHLA-E)对子宫内膜癌诊断及预后判断的价值。

方法：选择2016年6月至2019年6月在本院接受治疗的82例子宫内膜癌患者作为研究对象，即为子宫内膜癌组；选择同期80例子宫良性病变患者为对照，即为子宫良性病变组；选择同期健康体检的60例健康者作为健康组。

对3组研究对象的临床资料进行分析。

结果：3组研究对象糖类抗原125(CA125)、人附睾分泌蛋白4(HE4)以及sHLA-E水平比较差异均有统计学意义(F=290.928,P<0.001；F=382.416,P<0.001；F=52.673, P<0.001),子宫内膜癌组高于子宫良性病变组和健康组，子宫良性病变组高于健康组，随病情的严重程度呈现上升趋势(P<0.05)；子宫内膜癌临床分期为皿、"期的患者sHLA-E水平高于I、II期，差异具有统计学意义Q=2.399,P=0.019)；随访18个月，子宫内膜癌复发患者sHLA-E水平明显高于无复发患者，差异具有统计学意义(¢=2.088,P=0.040)。

Pearson相关性分析的结果显示，子宫内膜癌患者sHLA-E水平与 CA125.HE4水平均呈正相关(r=0.513,P<0.05；r=0.539,P<0.05)。

ROC曲线分析结果显示,sHLA-E 水平在诊断子宫内膜癌时的AUC为0.823(95%C/0.755-0.878,P<0.01)，敏感度为73.17%，特异度为78.75%。

结论：子宫内膜癌患者sHLA-E水平明显高于子宫良性病变患者和正常人群，且随着病情严重程度及临床分期呈现上升趋势；检测sHLA-E水平可有助于子宫内膜癌患者的诊疗及预后评估。

［关键词］子宫内膜癌；人类白细胞抗原-E；糖类抗原125；人附睾分泌蛋白4
［中图分类号］R737.33［文献标识码］A［文章编号］1671-7562(2021)01-0023-05
doi：10.3969/j.issn.1671-7562.2021.01.005
［收稿日期］2020-07-26［修回日期］2020-11-28
［作者简介］吴世丽(1982-),女，海南定安人，主治医师。

E-mail：306410955@
［引文格式］吴世丽，许莉，陈永香.人类白细胞抗原-E对子宫内膜癌诊断及预后判断的价值分析［J］.现代医学,2021,49(1):23-27.。