大规模细胞培养及发酵技术

渗透压
• 用于对引进的培养基进行质量控制
• 关联渗透压与细胞数、细胞活性和产量的关系 • 监控连续补加营养引起渗透压的增加
细胞密度
• 细胞密度通常等于 “生物量”
– 它是指给定体积的细胞数，可以是体积浓度或百分比 浓度.
– 它不是指活细胞数量 (但可很好显示细胞活力）
• 细胞活力/活性测定取决于细胞的种类、细胞生命周期及膜 的结构.
Cell Counts vs Ammonia Levels Over Time
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
C.D. 1 NH3
8 7 5 4 3 2 1 0
2 3 4 5 6 7
Cell Density (cells/ml)
• 铵的水平也取决于细胞密度和细胞代谢 方式. • 引起细胞抑制的铵离子浓度范围: – 从: 0.5 mM (L Mouse Cells) – 到: 40.0 mM (M. Ascites Tumor Cells) (不同的细胞株对铵有不同的耐受度)
• • • • • •
乳酸 NH4+ 磷酸盐 乙醇(酵母) 甲醇(酵母) 细胞密度
微生物高密度培养
发酵培养基 表达基因的调控 宿主菌 质粒的拷贝数及稳定性
高密度培养的关键是发酵的补料控制,根据 重组菌的生长特点及产物的表达方式采 取合理的营养物质的流加方式 恒速流加 变速流加 指数流加
微生物高密度培养乙酸的形成:培养液中葡 萄糖的含量超过菌体生长所需量或在缺氧 的情况下,便会大量产生乙酸. 减少乙酸的策略: 限制性流加葡萄糖 甘油代替葡萄糖 降低培养温度
• 宿主菌 • 降低比生长速率 • 透析培养
细胞培养和微生物发酵中的重要 参数
了解生物技术的应用
pH
• 不同的细胞具有不同最佳 pH范围 • pH 能影响葡萄糖和谷氨酰 胺的代谢，在低pH条件下， 葡萄糖消耗速度慢 • pH能影响细胞的生长和目标 产物的量
大规模细胞培养和微生物发 酵技术
细胞培养的概述
• 动物细胞的特点： 无细胞壁 倍增时间长，生长缓慢 需氧量少，对搅拌敏感 聚集体形成 原代细胞培养50代即开始退化
动物细胞培养的概述
• 动物细胞培养的定义：动物细胞与 组织培养是从动物体内取出细胞或 组织，模拟体内的生理环境，在无 菌、适温和丰富的营养条件下，使 离体细胞或者组织生存、生长并维 持结构和功能的一门技术
谷氨酰胺
• 监控谷氨酰胺的水平: – 确保细胞生长所需的能量. • 开发长时间细胞培养标准化补料策略. • 计算谷氨酰胺的消耗速率和决定批次培养最佳的其始 浓度.
谷氨酸
• 需用来计算谷氨酰胺
– 需确证谷氨酸 的浓度，确保没加进谷氨酰 胺结果.
• 谷氨酰胺的降解产物
Na/K
Na-K:
– 对合适培养基生产很重要. – 维持溶液/培养基合适的离子强度.
动物细胞培养的概述
• 生长特性 贴壁生长型：如人胚肺细胞，Hela 细胞，巨噬细胞，神经细胞 悬浮生长型：如血液白细胞、淋巴 细胞等
体外培养细胞的基本技术
• • • • • • 体外培养特点 体外培养工具 体外培养条件 体外细胞生长增殖过程 培养方法 大规模培养技术
体外培养的特点
• 营养条件苛刻 • 适应性差，敏感 • 培养时间长，易污染
• 增加换液的速率 (补料). • 维持培养液中低的谷氨酰铵浓度减少其转化和降解. • 在低的 pH培养减少NH3形成. • 去除培养液中的铵: –酶转化 –通过特殊的 “PTFE” 膜将 NH3 扩散到低pH 溶液中 • 使用能够逐步接受高 NH3 浓度的细胞
谷氨酰胺
• 与葡萄糖一样, 谷氨酰胺也是细胞的主要物质: * 碳和氮 * 能量 • 谷氨酰胺通常被认为是细胞培养的主要限制营养 –谷氨酰胺是生物合成的前体物质: * 嘌呤 * 嘌呤核苷 –谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和天冬的主要氨基受体
DO(溶氧）
葡萄糖等需氧来氧化产生ATP 供细胞的能量 • 用于测量和跟踪细胞消耗氧 的速率.
Oxygen Consumption Rate of Cells in Culture
O2: mmol/L
0.3 0.2 0.1 0 10 15 20 25 30 35 40 45
Time (min)
溶氧
葡萄糖
• 葡萄糖两个主要的功能: – 细胞的主要的能量物质 – 主要的细胞碳源
6 Gluc & Cell Density vs Time in Batch Culture 2 1.5 1 0.5 0 0 15 30 45 60 75 80 85 90Time (min)
Cell Count (cells/ml)
• “活性取决于你怎样定义细胞.”
细胞密度
• 细胞密度不意味着终产物量或生产率
– 它显示 ‘细胞体积/数量’, 但不能体现:
• 是否细胞是正确细胞. • 是否终产物是由细胞产生. • 是否所有的细胞是活的.
• 在细胞中的终产物的量.
体外培养的条件
• • • • 温度，37℃ pH：7.2-7.4 气体：氧，二氧化碳，氮气 营养条件：需要多种氨基酸，维生素， 辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长 因子，其中多种成分可由血清提供
细胞大规模培养技术
细胞大规模培养的方法
• 反应器贴壁培养
容易换液，不需特殊的分离细胞和培养液的设备 ，可采用灌流培养获得高密度，但扩大规模较 难，适合制备量小，价值高的生物药品。（ CelliGen PlusTM）
渗透压
• 渗透压是溶液浓度的一个反应: –测定渗透压的参考方法是使用渗透压计 –典型细胞培养液渗透压值: 300 +/-30 mOsmol/kg. • 渗透压升高 50-100 mOsmol/kg 会明显影响某些细胞的 生长. • 某些溶液/化合物可作为渗透压的保护剂 (维持渗透压稳 定和更低). 这些物质: – 甘氨酸，肌氨酸，脯氨酸
Time (min)
Ammonia (mM)
6
铵
pH 会受 NH3增加的影响: NH4+ <<>> NH3 + H + •铵的增加也会改变细胞内蛋白质的运动.监控发 酵罐和生物反应器中铵的水平（废物）.
•推算谷胺酰胺的降解水平.
•考察铵浓度对细胞密度和产物浓度的影响.
•监控引入培养基的质量.
限制铵抑制的策略
细胞大规模培养的应用
• • • • 生产疫苗 蛋白质和多肽药物统：酿酒、抗生素、制醋 基因工程：生产蛋白质药物、疫苗等 （大肠杆菌、酵母） 一般采用高密度发酵技术
微生物培养
培养过程决定于： 菌种 培养条件
微生物培养过程重要参数： 温度 pH 溶氧 葡萄糖/甘油 乙酸
透析培养细胞培养和微生物发酵中的重要参数了解生物技术的应用ph不同的细胞具有不同最佳ph范围ph能影响葡萄糖和谷氨酰胺的代谢在低ph条件下葡萄糖消耗速度ph能影响细胞的生长和目标产物的量effectsiggproduction1020304068727476phunits与碳酸氢盐形成缓冲对稳定培养液中的ph水平增加会抑制细胞生长和细胞活性从而影响目标蛋白的表达当溶液中co达到1415时会严重抑制细胞的生长codo溶氧葡萄糖等需氧来氧化产生atp供细胞的能量用于测量和跟踪细胞消耗氧的速率
• 葡萄糖和谷氨酰胺是相互补充的: – 产生其他代谢物 (例如: 天冬氨酸) – 提供能量 – 在所有细胞中通过糖酵解途径转变 成丙酮. • 葡萄糖的代谢随细胞生长而增加. – 葡萄糖通常是细胞生长的限制因素
5
Gluc (mmol)
4 3 2 1 0
葡萄糖
• 监控细胞反应器和发酵罐中的葡萄糖水平: – 保证细胞正常生长所需能量. • 开发延长细胞培养周期的标准补料策略. • 计算葡萄糖消耗速率和决定批次培养最佳的起始浓度.
乳酸= 氧化问题
• 在培养过程中，大多数乳酸来自于 葡萄糖代谢，但也有一部分来自于 谷氨酰胺代谢. – 基于高细胞密度和深液位，氧的 消耗非常大. – 典型的范围 (组织培养): 0 5 g/L • O2 消耗导致乳酸的形成，最终导致 pH的下降. – 对恒定的 pH:抑制细胞生长的乳 酸水平在低到 4 mM 到高达 70 mM (取决于细胞). • 在大多数情况下，铵对细胞生长的 抑制比乳酸更严重.
Gluc & Lact in Batch Culture
Gluc/Lact mM
25 20 15 10 5 0 0
Lact Gluc
1
2
3
Time (days)
4
5
6
乳酸
• 监控长时间细胞培养中乳酸的积累.
• 计算乳酸产量与葡萄糖的消耗之间的代谢关系
• 考察乳酸盐对细胞表达产物的毒害影响
铵
• 细胞培养和发酵中铵的来源: – 主要来源: 代谢谷氨酰胺(谷氨酰胺 降解) 谷氨酰胺降解成铵和吡咯烷酮酸 – 其他氨基酸的脱氨基作用
动物细胞大规模培养过程中 重要参数
• • • • • NH4+ K+/Na+ Ca++ 渗透压 细胞密度
动物细胞大规模培养存在的 问题
• 细胞凋亡 • 细胞在高密度条件下，由于细胞的 多层生长，存在细胞接触抑制效应 ，细胞的生长和表达均受到严重影 响
动物细胞大规模培养存在的 问题
• 细胞凋亡主要是细胞生长的条件较恶劣 ，包括： 1.营养缺乏 2.有害代谢产物的积累 3.pH和溶氧控制不当 4.机械搅拌剪切力较大 5.渗透压
Effects of pH on IgG Production
40
log H+
30 20 10 0 6.8 7 7.2 7.4 7.6
pH Units
CO2
CO2 + H2O <<>> H2CO3 <<>> H+ + HCO3• 在细胞培养过程中，CO2 与碳酸氢盐形成缓冲对，稳定培养 液中的 pH • CO2也可用于计算呼吸商，反应细胞活力和代谢旺盛程度 • 细胞代谢（呼吸作用）会产生CO2 (废物) – CO2 水平增加会抑制细胞生长和细胞活性，从而影响目标 蛋白的表达，当溶液中CO2达到14-15%时，会严重抑制 细胞的生长
• 在细胞培养和发酵过程中，O2 通常是限制营养成分，是因 为它在溶液中低溶解度:
–通常关心对培养液中 % O2, 也就是“溶氧” 值 (DO): –理论DO: 80% +/- 5 % (哺乳动物细胞培养) > 90 % DO2 (细菌培养） –O2 也可能通过自由基形成对细胞造成伤害,在低pO2 水平，细 胞的活性通常越高 (O2 值必须维持在最低的水平) –然而, 原代细胞可能在低 O2 条件下繁殖受延迟 因而，维持正确的O2的平衡，对保证所有细胞正确生长 都非常重要,一般30-50%
• 微载体培养
最有前途的动物细胞大规模培养技术，兼有悬浮 培养和贴壁培养的优点，易于放大。（Cytodex ，Cytopore和Cytoline）
• 无血清悬浮培养
用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血 清的一种细胞培养技术
动物细胞大规模培养过程中 重要参数
• • • • • • • pH 溶氧 温度 谷氨酸/谷氨酰胺 葡萄糖 乳酸 CO2