细胞培养准备工作

一：细胞培养实验室的设备:
1.仪器:
(1)倒置相差显微镜
(2)CO2培养箱
(3)电热干燥箱
(4)水纯化装置
(5)冰箱:普通冰箱(培养液,生理盐水,Hank’s液,短期保存的组织标本)和-20℃冰箱(保持生物活性及较长时
间存放的制剂如酶,血清等)
(6)液氮容器:储存细胞
(7)离心机(4000rpm,1000rpm即可及天平
(8)高压蒸气消毒气
(9)滤器:Zeiss滤器,玻璃滤器,微孔滤器等。

(一次性滤器：12.00×10)
(10)消毒培养液，
(11)血清
(12)消化用胰酶等。

2．培养用器皿：
（1）培养瓶：250ml,100ml（4.50×20）,25ml（3.50×10）
（2）培养皿：10cm,9cm（3.50×10）,6cm（2.50×10）,3.5cm
（3）多孔培养板：96孔（16.50×1），24孔（16.50×3），12孔，6孔，4孔
（4）玻璃瓶：1000ml,500ml,250ml,100ml,50ml,25ml,5ml
（5）吸管：刻度吸管（吸取，转移液体：1ml,2ml,5ml,10ml）（3.00×10）直头吸管（吸取，转移液体）弯头尖吸管（吹打，混匀，传代细胞）
（6）加样器：微量加样器用于吸取，移动液体，滴加样品
（7）其他用品：铝饭盒，橡皮吸头，胶塞，注射器，烧杯，量筒，漏斗
3．器械：
（1）手术刀
（2）手术剪，眼科剪（18.50）
（3）血管钳
（4）眼科镊（8.50），小弯头镊
（5）钟表镊
二．培养用品的清洗和消毒灭菌：
1．各种类型毛刷,橡胶手套，消毒所用包装（牛皮纸，棉布，棉线等）
2．洗衣粉，洗涤剂
3．5％稀盐酸浸泡中和碱性物质
4．清洁液（次强液：重铬酸钾120g，浓硫酸200ml，蒸馏水1000ml）需陶瓷或塑料器皿
5．消毒剂：75％酒精或0。

1％新洁尔灭消毒皮肤，无水乙醇（用于酒精灯）
6．抗菌素：青霉素，链霉素
三：培养用液：
1．平衡盐溶液：D-HANKS液(g/l )PH试纸
Nacl 8.00, kcl 0.40, Na2HPO4.H20 0.06, KH2PO4 0.06,NaHCO3 0.35,酚红0.02
2．合成培养基：M199培养基或DMEM培养基（Gibico公司一袋1000ml 65.00,Hepes 25g
120.00）
DMEM 一袋，Hepes 3.57g,NaHCO3 2.2g,三蒸水1000ml，青霉素100u/ml,链霉素100ug/ml
ph=7.2~7.4
3．FBS胎牛血清（原代培养20％传代培养10％）(100ml 200.00)
四：组织块的分离方法：
1．剪切分离法：组织块在0.5mm2~2mm2内，大小影响不大（可调整翻瓶时间以保证组织块贴壁），关键在于组织块边缘整齐，光滑，要求取材迅速，动作轻柔，剥除外膜时用力适中避免机械损伤，将镊子夹过处剪去，血管纵向剖开后平铺于平皿上，手术刀片无菌，洁净，锋利，垂直下刀，力求一次切断，不要离开培养液操作，保持边缘湿润。

2．消化分离法：※
（1）胰蛋白酶法：(25g 210.00)
（2）胶原酶法：
五：原代培养方法：
1．贴块法：在培养皿内将组织块剪成1mm3左右的小块，剪时可滴加1～2培养液，以保持湿润。

将剪切好的小块用吸管吸入培养瓶中，均匀摆置，每小块间距0.5cm左右。

轻轻翻转培养瓶，使组织块朝上，向瓶内注入少许培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在37度培养箱内。

6小时后轻轻翻转培养瓶，静置培养。

若组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂薄层血清，胎汁。

（10％胎牛血清，10％胎儿血清，0。

03％L-谷氨酰氨。

110mg/l丙酮酸钠，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素）
贴块法具有获得平滑肌细胞纯度高，量多，操作简便的优点。

但用贴块法易使平滑肌细胞胞质内肌丝丧失，亚细胞器增加。

2．酶解法：组织块剪成1～2mm3,转入新鲜配置的0。

2％Ⅰ型或Ⅳ型胶原酶消化液中，37℃恒温摇床（25r/min）消化，消化液混浊，尚存有较小组织块时，将消化液移入离心管内，收集细胞并用培养液轻轻吹打混匀。

细胞计数（0。

1％台盼蓝），50ml培养瓶接种约8×105活细胞。

（沿动脉纵轴切开后，刮除内皮细胞撕下中膜的内2/3，注意不要混入内皮细胞，将组织块切成1-2mm2，放入加有3mg/ml胶原酶的无血清M199培养基中，37℃，0.5～1.5h。

离心去上清，重复上述消化步骤，然后再离心（9000r,4min），收集细胞，在5%～10%同种血清或胎牛血清的M199培养基中调整细胞数，然后转入30～90mm培养皿中培养）
酶解离法，由于酶的作用使细胞间失去连接，细胞内肌丝含量丰富，保持收缩型状态。

3．贴块＋酶解法：对未消化完全的组织块采用贴块法接种瓶壁，先置培养箱2h使组织块干固，然后补加培养液，37℃静置培养，3d后换液。

4．注意：
①种植组织块的数目，如75cm2的长颈瓶组织块不得少于30个；
②根据培养细胞的种属加入适量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，应加胎牛血清（FBS），通常浓度为10%～20%
六：传代培养：原代培养3～5d，需换液一次，去除飘浮的组织块和残留的血细胞。

然后隔天换液。

当内皮细胞长成单层，平滑肌细胞出现峰谷样特点时可传代。

消化法传代。

加入0.125％胰蛋白酶1ml，轻轻转动培养瓶，使胰酶充分接触细胞后去除大部分液体，镜下观察，3～5min后，细胞呈收缩状，弃尽消化液，DMEM培养液洗两遍，加10％FCS DMEM培养液，用弯头吸管轻轻均匀吹打细胞，使细胞自瓶壁脱落，镜下观察细胞计数，按1：2～3比例传代。

七：细胞系的维持：
八：培养细胞的纯化：
九：细胞冻存与复苏：
十：培养细胞生长状况的观察：
1．肉眼观察培养液：颜色，透明度
2．相差显微镜下观察：http://202.116.64.20/wjf/2/course/c212.htm相差显微镜与倒置显微镜的区别光学倒置显微镜下观察：原代平滑肌细胞形状多样，一般常为梭形、带形、三角形或星形。

贴块法培养，细胞可于2周后长成单层；而酶解离只需6～7天，镜下可见明显“峰-谷”样生长。

透射电子显微镜下观察：贴块法，细胞多为合成型，肌丝减少，胞体缩小，细胞胞质内粗面内质网、游离核糖体、线粒体等亚细胞器逐渐增多。

消化法，细胞初期表现为收缩型，细胞内核位于中心，胞质内含丰富的肌丝及致密度体。

亚细胞器少，且位于细胞边缘处，基底膜最初未见，后来逐渐形成。

传代后，细胞逐渐转为合成型，胞体增大且变扁平，核增大，核小体数目增加，亚细胞器也增加，肌丝开始减少，占胞内35.4%～11.5%,甚至更少。

在生化性质方面，收缩型细胞比合成型细胞的β-极密度脂蛋白（β-VLDL）对其受体结合能力强，低密度脂蛋白（LDL）分解降低，即脂质容易在胞质沉着。

此外，像基底膜中的肝素样物质、胆固醇代谢等也有改变。

合成型细胞内色素C氧化还原酶成倍增加，酸性磷酸酶亦呈3～4倍增加，说明这两类细胞不仅在形态学上，在生化、生理反应方面也发生了较大改变。

3．细胞生长状况的观察：细胞计数：计数板
4．细胞活力的检测方法：四唑盐（MTT）比色试验
（1）：0.125%胰蛋白酶消化
（2）：加10％FCS的DMEM培养基
（3）：96孔板
（4）：MTT溶液: /yhcb.htm ( MTT. SIGMA. 250MG. 190．00.)活细胞中的琥珀酸脱氢酶还原MTT为难溶性的蓝紫色结晶
（5）：DMSO：二甲基亚砜溶解蓝紫色结晶物
（6）：酶联免疫检测仪：490nm处测定吸光值
5． 3H-TdR掺入量测定：？
6．平滑肌细胞cGMP测定：？。