植物可催化芥子油苷水解的酶通常具...

西兰花再生体系的建立及遗传转化体系初探的研究
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№研究生学位论文独创声明和使用授权书
独创声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

据
我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他已经发表或撰写过的
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日期:加;年月日
学位论文作者签名:宓也
醐‖眸钼日
鲫锑:狲摘要
摘要
芥子油苷.是一类含氮、含硫的植物次生代谢产物,主要分布于十字花科植物中。

芥
子油苷及其代啪翘凯具有广泛的生物学效应。

近年来,芥子油苷在参与植物的防御反应和抗癌等方面引起
了极为广泛的关注。

当芥子油苷在黑芥子酶的作用下,会水解生成一系列活性物质,这些活性物质在植物
防御昆虫、草食动物及病原菌的侵袭过程中起重要作用;某些脂肪族芥子油苷的水解产物表现出很强的抗
癌活性,其中.甲基亚磺酰丁基芥子油苷即萝卜硫素的水解产物是迄今为植物中发现的抗窟活生撮强的
化学成分。

提高渣物中萝卜硫素的含量,培育艮剞亢壹活性的功能蔬菜,是?个值得深入研究的问题。

近年来,大量的国内外研究证实经常食用某些十字花科的蔬菜,如西兰花、花椰菜、萝卜、白菜
等可降低人门罹患多种不同肿瘤疾病的风险,存在于这些植物中的具有抗癌活性的物质就是萝卜硫素,萝
卜硫素的前体物质是由.基因催化生成的。

在常见的十字花科蔬菜中,西兰花中萝卜硫素的前体
物质含量远远地超过了其它蔬菜,尤其在幼嫩组织中的含量更高,若能通过基因工程手段过量表达
基因,则有望获得具高抗癌活性的西蓝花,为癌症的治疗起到有益的辅助作用。

本研究以西兰花下胚轴为外植体,讨论了影响西兰花再生体系的诸多因素,建立了西兰花再生体系,
结果:表明:不同的基因型只寸夕卜植体的不定芽分化率有很大的影响。

本实验中珠绿、青:秀的不定芽分化率分别
为.%和.%,都要高于其它三个品种;苗龄刘.夕植体的分化也有一定的影响,实验中比较了珠绿和
青秀在不同苗龄下的不定芽分化率,表明珠绿与青秀都是时的分化痒最高,分另为.%和.%;
激素是影响不定芽分化的重要因素,本实验中添加/和/时,珠绿和青秀的不定芽分
化率都是最高,分别为%和.%;在培养基中添加会显著提高不定芽分化率,当添加
/时,珠绿和青秀的不定芽的分化率最高,分别为.脚%;在生根培养基中添加.
时,生根效果最好,珠绿和青秀的不定根分化率分别为.%和.%。

构建了植物表达载体
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并且还初步挢哮;了西兰花的遗传转化体系,最适合珠绿的卡胃障酹莉箭蚯力为/,
最适合青秀的卡那霉素筛选压力为/;同时确定了侵染时间,外植体的最适侵染时间为
/羧苄青霉素便可以完全的抑制农杆菌的生长,不定芽的分化率最高。

关键词西兰花;芥子油苷;再生体系:遗传转化体系:用钇胛;.
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引言
引言
.研究的目的与意义
近年来,大量的国内外研究证实经常食用某些十字花科的蔬菜,如西兰花、花椰菜、萝卜、白菜
等可降低人们罹患多种不同肿瘤疾病的风险,存在于这些擅物中的具有抗癌活性的物质就是萝卜硫素。

在
常见的十字花科蔬菜中,西兰花中抗癌活性物质萝卜硫素的含量远远地超过了其它蔬菜,尤其在幼嫩组织
中的含量为最高。

此外,西兰花营养也很丰富,富含矿物质、蛋白质、碳水化合物、纤维、维生素
等。

西兰花的维生素含量是洋白菜的至倍,是西红柿的至倍,胡萝卜素是白菜的多倍。

近
年来,随眷喇鳓的扩大西兰花已成为我国南北方的常见蔬菜。

西兰在篙珥嗣斗喳物由于啥咭黼活性彩蛋质萝卜茄溺缸矿卣效预防癌症的发生,这.呜鸵仑砒国内外
科学工作者多年开究已经陂广泛接受。

通过欢鼬榴鼐卿控带螺旋并怍为癌症渝宁的辅助手段比荮睃圾手
术渝晓具瘸更多的优势。

尽管西兰花中含有丰富的萝卜硫素,但其抗癌功效与摄入剂量密切相关,日常饮
食的摄入量对癌症的预防可以起到积极的作用,但对于癌症的控制和治疗则是不够的,利用基因工程技
术,将萝卜;漕雏泪凇中的关键酶基因在西兰花中过量表达,培育出高含量萝卜磅;素的功能
蔬藕垂兰花,对撇的预防与控韦嘴具有重士毒泌。

培育转基因西蓝花的主要技术问题是建立西蓝花的再生体系和遗传转化体系,本研究成功地建立了西
蓝花的再生体系,并时副专转化中的几个主要因素进亍初步探索,拟克隆拟南芥中萝卜硫素合成过程中的
关键催化酶基因,构建强启动子调控的植物表达载体,将其转入西蓝花,以期获得具有高抗癌
活性的西蓝花,同时为基因工程改良西蓝花提供方法和技术上的参考。

.文献综述
...芥子油苷的化学结构与合成途径
芥子油苷通常由讳辩薯糖基、硫化肟基团以及来源氮基酸的侧链基团组成见图一。

根据侧
链氨基酸的来源可队将芥子油苷分为侧链来源于甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的脂肪族
油苷、侧链来源于苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族芥子油苷和测链来源于色氨酸的吲哚族芥子油苷。

东北农业大学硕士学位论文
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图芥子油苷的化学结构
耳. 日如斌
植物可催化芥子油苷水解的酶通常具有?种葡糖硫苷酶的活性,像已知的黑芥子酶,它可以水解芥子
油苷主链凰架匕的葡萄糖基,水解的产物是葡萄糖和?种不稳定的糖苷配基。

大多数芥子油苷的集团都
会被?些前体氨基酸广泛地修饰,尤其是经过甲;氨酸的修饰后,基团会有?个很大程度的转换。

大部
分的基团恿过加入?个或多个亚甲基来延长。

延长的和没延长的基团都会有各种各样的转换,包括
羟基化、甲基化、去饱和、糖基化和乙酰化,重新排碉腼形成异硫氰酸盐、腈希明荆五盎:物。

在蒉整的植物
当中,这种水解作用受到了阻碍而不能发生,因为芥子油苷和黑芥子酶在空间彼此之间是分开的,但是
一旦植物组织受损,这两种物质就会结合到?起,致使芥子油苷的水解产物快速的形成。

大多数芥子油苷
的生物活性都归因于它们的水篇产物。

芥子油苷的合成可以简单的分为三个不同的阶段。

第一,特定的脂肪族的和
芳香族的氨基酸通过在它
们的侧链插入亚甲基团来延长。

第二,无论氨基酸本身是否被延长,它都会被重新配置而形成芥子油苷的
杨心结构。

第三,最初形成的芥子油苷被各种各样的次级转换物质所修饰。

氨基酸链的延伸
对于芥子油苷生物合成的过程来说,氨基酸链延伸途径的顺序是基于?些研究结果的,如体外饲养的
研究,体外酶活性的证明和关键中间体的分离。

开始,初始氨基酸脱氨基,形成相应氧酸二氧酸。

接下
来是?个三个步骤的循环,在循环中,埠稍乙酰辅酶结合形成?个代替的.苹果酸盐衍生物,这个
衍生物翎恿过?个,霸径基的异构化转变成?个埠果酸盐衍生物,然后卑果酸盐衍生物会进行氧化
脱羧生威比起女复合物多?个亚甲基团的物质。

在每?个延长循环当中,这两个乙酰辅酶的碳原子
劫口到氧酸匕,前?个循环中加上的羧基被脱去,进而形成?个多?个碳原子的.氧酸。

每?轮的循环
之后,延伸了的辛暖浍被诱导转氨形成相关的氨基酸,并目进入芥子油苷合成的第二个阶段。

或者它可
以’进:行另?轮的与乙酰辅酶的缩合,异构化,氧化批作用,导致进?步链的延伸。

在植物当中,这
个循环会有次见图。

;飞图.芥子油苷氨基酸链的延伸.
核心结构的形成
芥子油苷核心结构的蚴胎成涉及叫鲕葡仔油苷共有的中间产物。

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图芥子油苷核心结构的形成
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素豸漱中的单.力晴靶朗搀摧化下生成乙醐亏,乙醛艇莎琵渤脆睡.素豸嗾中的单
加氧酶的催化下生成硝基复合物,∞硝基复合物在谷胱甘肽硫带移酶的催化下生成疏塌.基硫代异
羟肟酸,硫彬氇揪异羟肟酸在睽硫裂解酶的作用下生成硫代异羟肟酸,硫代异羟肟酸经过硫葡糖转移
酶催化,生成脱磺基芥子油苷,最后在磺基转移酶的崔化下,脱磺基芥子油苷生成芥子油苷见图。

次级结构的修饰
最开始形成的芥子油苷的基团会进一步的受到大范围的燃用。

这些生物学和生物化学的反应不
但影响芥子油苷水解的方向,而目影响水解产物的活性。

起源于甲硫氨酸的芥子油千的基团和它的边链
延长了的同系物会进?步的进行特殊的修饰,例如甲基硫烷基边链匕的硫原子的逐步氧化,依次产生甲基
亚碟弼瞒秭甲基碟吲镬糖部分见图。

催化篇一次反应的酶为.基因历趑的酶,当便链
基团中时,第一次氧化的产物即为萝卜硫素。

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图芥子油苷次级结构的修饰
Ⅱ
....芥子油苷在抗虫中的研究
植物在生长的过程中会经常暴露在影响其生长的压力之下。

在这些诸多的压力当中,害虫会对溘物的
生长造成毁灭性的影响。

为了克服这些挫折,植物会有很多种方法来保护自己。

芥子油苷在植物保护其防
止被害虫侵害方面就有很突出的作用。

这些起源于氨基酸的次级代蒯产锄僦于十字花科及其相关豸嗾的
植物当中,包括油菜籽,卷,睛翱磁魅妫斟勿炯痧等等。

在植物组织受到破坏时,非毒性的芥子油苷在黑
芥子酶的催化下,快速地水解成为具有生物活性的水鳃产物。

在这些水船宁呦当中,这种芥子油苷.黑芥子
酶系统的防御作用主要归因于异硫氰酸盐,它对微生物,线虫和昆虫有一定毒性作用。

引言
Ⅺ研究结果表明芥子油苷的生物合成包括三个阶段:首先,氨基酸前体舰慌
的延长;其次,芥子油苷
楱心结构的形成:最后,次级结构的修饰,包括双键的形成,水解及甲基化反盟¨。

在芥子油苷核心结构
生物合成的第?个步骤中,前体氨基酸被转换成相关的乙醛肟。

在芥子油苷和生腈糖苷的生物合成过程
中,这是很普通的?个步骤。

在芥子油苷和生腈糖苷的生物合成过程中,乙醛肟的形成是被家族中
;断
的细胞色素单氧化确崔化的。

这些的同系化合物已经在拟南芥中过表达。

拄研究茂现来源于蜀黍的, 会将酪氨酸转化成憾苯乙醛肟,来源于木薯的会将缬氨酸和
异亮氨酸转化成相关的乙醛肟,来源于拟南芥的Ⅵ仍会催化从苯基丙氨酸到苯基乙醛肟白勺转化儿。

转
基因拟南芥中过表达这些同系化合物会使芥子油苷的积累达到?√艮高的水平,这些芥子油苷不存
在自然界当中的捌南芥中,或积融于极少数的拟南『芥中【司。

除了这些内部的化等物质,植物也有?些自
身的屏障,如叶子的毛状体,它可以阻止昆虫产卵和咬食。

早期的研究已经证实芥子油苷的积累会降低一
股食草动物对植物的进食,然而,在芥子油苷水平变化的情况下,特殊的食草动物却没有任何对植物进食
的表玛矿】。

小菜蛾,具有菱形斑纹的飞蛾,是?种特殊的食草动物,被认为是
对芸薹属作物有破坏作用
的害虫。

这种菱形斑纹飞蛾通过嗅觉、味觉和触觉被它的宿主吸引【列。

之前产卵的研究表明菱形斑纹飞蛾
僦非宿主植物产卵【。

成年的菱形斑纹飞蛾会被它们的宿主植物散发的不稳定气味所吸弓【?。

当提供造的:学兼蚤荆宿主叶子的时候,完整的芥子油苷和源于脂肪族芥子油苷的不稳定的异硫氰酸
盐都会刺激菱形斑纹飞蛾产卵【¨】。

菱形斑纹飞蛾幼虫的进食不仅仅受芥子油苷和其他次级代谢物的刺激
陲】,也被一些营养物质所触发,如糖类、氨基酸和植物体内的前体代谢物质。

它的幼虫自身会通过发生
生化反应去适应大量的芥子油苷和黑芥子酶的摄入。

在它们的内脏中,具有?种芥子油苷硫化酶,这种酶
可燃子油苷转变成去硫芥子油苷,去硫芥子油苷不会被黑芥子酶作用,并且会随着排泄物被排泄掉
踟。

...芥孑油营在抗病中的研究
植坜醢常通过?个先天的免疫系统来保护它们自己。

这个免疫系统的启动是以非己的识别为基础的。

对于?爪.融反应的激活来说,?种有机体具有探澳蛭艚在的病原体入侵的能力是至关重要的。

非己物质
的免疫识另网.西过受体配子的相互作用直接地.发生,并且也可通过宿主编
码的中间物间接地发生。

然而,
与动物不同的是,植物不能够把这种识别与它们自身Ⅸ姨的重组链接在?起。

因此,植物依赖?种它冼
天免疫系统的侧向膨胀去应游竞嘞的病原体种类。

这种情况下就产生了?种复杂的、分层的防御系
统,这种系统具有大量的高可虫皑宿主防御蛋白。

植物的防御反应是受其基因组控制的,目植物对病原体的抑制可以表现在物种和培育水平。

当?个植
物物种中某种特朔濯渤职寸哮彰掮原体抑制的时候,培育水平抑制才会发生,但不是整个物种。

培育水平抑
制经常伴随着局部的细胞凋亡,像已知的过敏反应。

这种奇特的反应通常是通过?种病原体决定因素的识
别而诱导的,这个决定因素是宿主编码的抑制蛋白。

抑制蛋白在?个物种中会不定的表达,因此,?个植
物物种在不同植物中对特定病原体的抑制有所不同。

与培育水平抑制不同的是,当整个植物物种都对特定的病原体抑制的时候,非宿主的抑制才会发生。

非宿主抑制归因于有效的被动防御,例如?个预制的阴拦或者有毒化学物质都会激活非宿主抑制。

非宿主
抑制也可以归因于由病原体识另腼诱导的主动防御。

这种主动防御有时会引起非宿主的抑制,包括过敏反东北农业大学硕士学位论文
应,但非宿主抑制经常是由基础的防御反应所引起的。

啪等研究表明,非宿主
抑制和培育水平抑制之间的界限划分不是很明显。

例如宿主抑制蛋白细菌效应分子的识别既有助于非宿主的抑制,又有助于培育水平的抑制。

病原体相关的分子模式
毋、加陶的识别也有助于这两种类型的抑制,但可能对非宿主抑制更有帮助【】。

基础防御喇‘于植物避开病原体.来说也是至关重要的。

但是这些防御普遍匕被认为是脆弱的、无效的。

从某方面来讲,这种观点已经被证实了,因为基础防御反应经常在可并存的相互反应中被观察到。

在这些
相互反应中,病原体不断增殖并且导致疾病的发生。

在可并存的相互反应中的基础防御会被削弱或者推
迟,因为病原体会有效的利用大量的分子,例如感受器蛋白和抑制基础防御的毒素。

...芥子油苷的抗癌研究进展
十字花科蔬菜中芥子油苷及其水解产物包括吲哚化合物、异硫氰酸盐和腈类物质等,摄入高量的十字
等研究表明,每天摄入一定量的十字≠占夸泰
花秭棘能降低患肺癌、结肠癌等癌症的风险。

№
等;耐砌
菜,可盼箭封电降氐患肺癌的风膨固。

面等;Ⅵ奴等;
等发现,患结肠癌的病通常比没患结肠癌的病少摄入很多十字花科蔬身删。

幽嚷等
; 等研究发现,芥子油苷的水解产物羟雌酮强烈的抑制乳腺癌细胞的增值口嘲。

等;囝等发现,芥子油苷的水解产物可以抑制前列腺癌细胞的生长,并且
吲
能诱导其细胞凋,唧。

等研究表明,人经常通过摄入十字粝阵籍莛来在体内积累吲哚化.合物
和异硫氰酸盐可降低患癌症的风险,但这种保护效果对于每个都不同,是由于个体对代’谢异琉氰酸盐的.; .硼亨诙明,十号硪弄懈中
能力不同。

;
含有大量的生物活性物质,如叶酸,维生素,维生素,类胡萝卜素和多酚冬尹冽。

等人得出
结论,十字花科赢潆中的抗癌活性:应该归因于其自身芥子油苷的含型田。

等形巴撩明,化学致搪物质司分为直拯扦乍用和间接作佣,而后者是最常见的。

虱搪濒的
激活主要是由期酶家埃崔化的,而致癌物质的解毒是由期酶家族崔化的。

?般来说,来自于细胞色素
家族的期躏罐弭值按作用致癌物质的、灏活,而期酶罐并值接作用和间接作用致擂舨的解
毒,如谷胱.甘肽硫.鬃移酶。

由于期酶很可能恩鼋隋效的化学懒质,因此,有人建议改变期酶和
期酶之间的平衡来诱导期酶的表达。

和发现,芥子油苷会在植物细胞受损的隋况下与
黑芥子酶接触,然后黑芥子酶会催化芥子油苷水解,生成?些次级代谢产物,如异硫氰酸盐、腈以及吲哚
化合耄垆。

等研究茂现,某种异硫氰酸盐,如萝卜硫素,是?种强力的期酶诱导物冈。

大
多数十字花科蔬菜中都含有大量的、对某些酶有调节作用的芥子油苷。

例如西兰花,它是萝卜硫素最主要
的饮食来源,通常也含有大量的芸苔葡糖硫苷,这些芸苔葡糖硫苷来源于吲噪甲醇。

等笈现,当暴霜在胃里酸生的条件下时,能够经过多次的缩合反应,形成一系列的二聚体、三聚体、
四聚体和低聚物【。

与萝卜硫素不同的是,和它的酸性聚合物会诱导期酶和期酶。

等
,; 等纠昵螽拔现,尽管十字花科蔬菜诱导期酶,但是也会诱导期酶,尤其
是,。

,的诱导有时是有害的,因为它们会激活许多致癌物质,并且
、
也会增加反应氧的产型。

许多研究发现,具有诱导许多期酶的能力,如环氧化物酶、铁蛋白酶、谷氨酸半胱氨酸合成
酶、谷胱蝴髫副艺物酶、谷胱甘肽还原酶、血红素加氧酶、硫氧还蛋白还原酶和葡萄糖醛酸轻移
引言
酶。

因为这些酶在细胞抵御癌症和?些有毒物质的各个方面都起到作用,所以
可显著的加强细胞保护
作用。

大量的研究结果表明, 相关蛋白.核因子相关因子。

抗氧化反应
元件信号途径主要负责这些酶对的相关反应见图.。

抽唱等硼贫痕明,期酶基因能够
在它们的’.空白区插入?个或多个顺式作用的调节元件,例如,并且的激活会导致相关
的期酶基因激活。

咆是的关键激活因子,在细胞质中,经常受到它的抑制子的约
束。

自由的也在细胞核中的位置经常变化,与其他核因子结合在?起并且与结合在?起去激活下
游基因的翻译。

蛐萌渤帽等研究发现,通过直接与的半胱氨酸残基的巯基基团作用来激
活咆。

但一竖聘滚明,改变的半胱氯勤.魅可台钥浞以:激活咆【】。

图芥子油苷降渤的抗癌机哩
.
等研究发现,核组蛋白的可逆乙酰化反应是基因调控的重要机制。

在正常的细胞中,组蛋白
乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶之间存在?个平衡,当这种平衡不存在时,癌症便会随之产生
阁。

的天然抑制剂,如曲古抑菌素,被人们认为是一种抗癌物质,因为它能诱导像
删矾一样的蛋白,而这种蛋白能够在转化的肿瘤细胞当中导致细胞循环受
阻、分化及凋亡。

~僦凼研究表明,对有腿的抑带悱佣嗣。

东北农业大学硕士学位论文
目前研究表明,在细胞内具有抗癌作用的物质很多,大多数为芥子油苷的代谢产物,如、异硫氰
酸盐等。

异硫氰酸盐的水解产物之?萝卜硫素被认为是最有效的抗癌物质。

国内外众多的研究者相继采用
许多不同的方法提高西兰花中萝卜硫素的含量,但相关的研究主要局限于传统育种方法。

尽管萝卜硫素的
生物翎书凇已经基本清楚,但最关键的酶?即催化萝卜硫素的前体.齐子油苷中的硫原子氧化的酶却多年来
一直不为人所知,这是基因工程方法提高西兰花中萝卜硫素含量的最大的障碍和挑战。

等
: .等成功地在蔑羽直勿南芥中预测并鉴定了个具有硫氧化功能的
酶璐。

这组酶的生睡功能就夷蚩化包括萝卜硫素在内的脂肮够;芥子油苷觏雎疏原子的氧
化。

研究表明如的催化活性最强,在过量表达的转基因拟南芥种子中,萝卜硫素含量
提高了倍【删。

萝卜硫素的研究进展
..
研究表明,十字花科植物的特点是能够产生源于氨基酸的、富含硫的自然。