SYBR Green I荧光定量PCRPPT教案
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第48页/共65页
问题1：无 Ct 值出现
检测荧光 信号的 步骤有 误: 一 般 SG 法采用 72℃ 延伸时 采集。 引物或探 针降解: 可 通过 P AGE电 泳检测 其完整 性。 模板量不 足: 对未知 浓度的 样品应 从系列 稀释样 本的最 高浓度 做起。 模板降解: 避 免样品 制备中 杂质的 引入及 反复冻 融的情 况。
第52页/共65页
问题5：重复性差
1.加样不准确。 2.仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。 3.模板浓度低。样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。
第53页/共65页
问题6：熔解曲线只有上升支
扩增产物 的Tm值 较高， 设置熔 解曲线 时改9 5 度为99 度。
第54页/共65页
95℃，10min； 95℃，15sec， 60℃，30sec， 72℃，30sec， 反应结束后，立即进行溶解f曲or线4分0 析cy。cles
95℃，15sec， 60℃，60sec， 95℃，15sec， 60℃，15sec。
第27页/共65页
第28页/共65页
第五部分：数据分析
授发明了具有划时代意义的 PCR技术。
第3页/共65页
PCR Polymerase Chain Reaction
vPCR (聚合酶链式反应)技术是一种体外快速扩 增特定DNA片段的方法。
v 是一个在引物介导下反复进行热变性、退火、 引物延伸三个步骤而扩增DNA的循环过程。
v运用PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的 DNA片段，使皮克(Pg，10－12）起始物达到 微克（μg，10－6）水平。
2 -△△CT
表示实验组目的基因表达相对于对照组变化的倍数。
ΔCt =Ct 目的- Ct 内参 ΔΔCt = ΔCt实验组- ΔCt 对照组
第40页/共65页
第六部分：误差校正
第41页/共65页
模板方面的误差：IPC校正 取样量即细胞数量、抽提效率、纯化损失、 反转录效率等
操作误差：ROX校正 试剂取用误差的主要部分、受耗材质量及仪 器等影响而产生的荧光激发波动
4℃：1周 -20 ℃：1年 -70 ℃：1年以上
DE第P1C5页水/共溶65页解
RNA的质量
RNA得率检测——分光光度计 260nm:核酸 280nm:蛋白等有机体 230nm:杂质浓度 320nm:溶液浑浊度
总RNA浓度（ng/µl） =OD260×40×稀释倍数（ng/µl） OD 260读数介于0.1～1.0之间可靠 （20～3200 ng/µl ）
cDNA为 1： 5 引 物 终 浓 度 50nm
第60页/共65页
问题11：模板降低时，扩增效率低。
cDNA 为 1:5稀 释
cDNA 为 1:10稀 释 cDNA 小 于 PCR反 应 体 积 的10% 。过低 ，扩增 效率低 ；过高 ，增加 非特异 性扩增 ，或者 因反应 抑制物 多，降 低扩增 效率低 。
模板起始 浓度不 相同， 扩增效 率基本 相同。
第58页/共65页
第59页/共65页
问题10：预实验时为单峰，正式时为杂峰。
cDNA为 1： 5 引 物 终 浓 度 100nm
cDNA为 1： 10 引 物 终 浓 度 50nm 引物有问 题：使 用另一 对引物 则为特 异性扩 增。
cDNA为 1： 5 引 物 终 浓 度 100nm
RT引物的选择
是 一 系 列 寡 核苷酸 片段的 混合物 ，它含 有各种 可能的 核苷酸 排列顺 序，因 此可与 任意核 酸序列 杂交。
第21页/共65页
RT反应条件
25℃,5min ；(随机引物加此步) 42℃,60min； 70℃,5min。
第22页/共65页
RT反应的注意事项
冰上操作
所有用具去RNase处理 戴口罩、帽子，勤换手套，防外源RNase污
染 尽量快速 4 ℃离心：室温会导致不适当分层，从而导
致变异RNA产物。
第13页/共65页
RNA的抽提注意事项
一、标本的处理
新鲜、低温保存、避免反复冻融。易至RNA降解，提取量下降。
二RNA；抑制RNase活性；酸性酚使RNA进入
99.0
第55页/共65页
问题7：扩增曲线异常
基线设置 有误。 高浓度的 模板会 导致C T 值过早出现， 即基线 范围变 小，导 致机器 读取荧 光数值 有误。
第56页/共65页
问题8：扩增熔解曲线不同，ct值却相同
模板起始 浓度相 同，扩 增效率 不同。
第57页/共65页
问题9：ct值不同，熔解曲线同，扩 增曲线还高
SYBR Green I荧光定量PCR
会计学
1
主要内容
第一部分：PCR简介 第二部分：RNA的提取 第三部分：RT 第四部分：实时荧光定量PCR 第五部分：数据分析 第六部分：误差校正 第七部分：常见问题分析
第1页/共65页
第一部分：PCR简介
第2页/共65页
PCR技术的发明
v 1985年教
是一种在PCR反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号积累实 时监测整个PCR进程，最后通过 特定数学原理对未知模板进行 定量分析的方法，实现了PCR从 定性到定量的飞跃。
第7页/共65页
实时荧光定量PCR技术分类
荧光探针 Beacon法：以美国人Tagyi为
代表 TaqMan探针:以美国ABI公司
模板量低 。
第50页/共65页
问题3：阴性对照有信号
Mix 或水被污染。
如使用R OX 校正，则可能 为R OX 降解所致。
引物二聚 体的出 现：3 5 循环后出现属 正常， 配合熔 解曲线 进行分 析 提 高退火 温度； 降低引 物浓度 ；冰上 操作； 重新设 计引物
第51页/共65页
问题4：溶解曲线不止一个主峰
理论扩增曲线
实际扩增曲线
第31页/共65页
第32页/共65页
第33页/共65页
第34页/共65页
第35页/共65页
第36页/共65页
Tm 值：双链DNA解 链50% 的温度 。
第37页/共65页
第38页/共65页
第39页/共65页
数据分析：
相对定量：不用得到绝对的拷贝数，只需计算表达差 异即可，得到的结果是某基因表达水平升高了或降 低了多少倍。
第29页/共65页
结果：
扩增曲线
熔解曲线
标本
阴性
标本
阴性
第30页/共65页
PCR扩增曲线
Rn （Norma lized report er）： 是荧光 报告基 团的荧 光发射 强度与 参比染 料的荧 光发射 强度的 比值。 △ Rn：△ Rn是Rn 扣除基 线后得 到的标 准化结 果（△ Rn=Rn- 基线） 。
配制混合液
试剂短暂离心
移液枪：用完之后要归到最大计量的位 置，防止久而久之弹簧失去弹性 。
第23页/共65页
第四部分：实时荧光定量PCR
第24页/共65页
SY法-PCR反应基本组分
v DNA Polymerase DNA聚合酶
v dNTP
四种脱氧核苷酸
v Buffer
缓冲溶液
v rox
内参染料
过多：会沉淀盐和其他污染物，使用乙醇不能洗脱。
五、洗涤： 75%乙醇
去盐作用，根据情况可重复几次。
六、溶解： DEPC水
掌握溶解时间。
太早：沉淀物太湿，含有乙醇会影响后续反应。
太迟：沉淀物太干，不易溶解。
第14页/共65页
标本
Trizol 氯仿
异丙醇 75%乙醇
4℃：过夜 -70 ℃：一个月
4℃：过夜 -20 ℃：时间长会使盐沉淀
cDN A为1： 5 引 物终浓 100nm
cDN A为1： 5
引物终 浓50nm
引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。
模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组 DNA的引入，或通过引物设计 避免非特异扩增。
其余误差：统计校正
重复实验，取平均第值42页/共65页
第43页/共65页
第44页/共65页
第45页/共65页
第46页/共65页
总结
设计合格的引物。 适当浓度的模板。 设定内参和阴性对照。 使用合适的ROX。 实验时做复孔。 冰上操作。
第47页/共65页
第七部分：常见问题分 析
第61页/共65页
问题12：未调基线和阈值
峰 型 不 佳 ， 影响ct值 。
第62页/共65页
问题13：熔解曲线出现 负值的峰
Sybr green 过 多 抑 制 反应 ？？
第63页/共65页
第64页/共65页
感谢您的观看。
第65页/共65页
第4页/共65页
2.PCR原理
第5页/共65页
PCR类型
RT-PCR 兼并引物
PCR 巢式PCR
• 重组PCR • 荧光定量PCR • 锚定PCR • 多重PCR • 定量PCR
……
反向PCR
不对称PCR
原位PCR
第6页/共65页
实时荧光定量PCR技术 real-time fluorescent quantitativePCR FQ-PCR
水相。
过多：上清液变为红色，浪费。
过少：未加氯仿前即分层。
裂解不充分， RNase抑制不充分，得率低，RNA完整性、纯度受损。
三、抽提、分层：氯仿
变性蛋白，抽提去除过多的酚，加速有机相与水相的分层。
过少：上述作用减弱，影响RNA质量。
过多：使DNA和蛋白进入水相，影响RNA质量。
四、沉淀：异丙醇
第49页/共65页
问题2： Ct 值出现过晚
扩增效率 低: 反 应条件 不够优 化。设 计更好 的引物 或探针 ；改用 三 步 法进行 反应； 适当降 低退火 温度； 增加镁 离子浓 度等。
PCR 产物太长: 一般采 用 8 0- 150bp 的产物长度。
PCR 各种反应成 分的降 解或加 样量的 不足。
第16页/共65页
RNA的质量
第17页/共65页
RNA完整性鉴定
第18页/共65页
第三部分：RT
第19页/共65页
RT反应体系
RNA 1μg
Primer 1μL
5×Reaction Buffer
4μL
RNase inhibitor（20U/μL）
1μL
第20页/共65页
10mM dNTP mix
为代表 FRET技术:以罗氏公司为代表
荧光染料 第8页/共65页 饱和荧光染料: EvaGreen、LC
第9页/共65页
第10页/共65页
第二部分：RNA的提取
第11页/共65页
提RNA基本步骤 标本
Trizol 氯仿 异丙醇 75%乙醇 DE第P1C2页水/共溶65页解
RNA的抽提注意事项
v SYBR GreenⅠ
荧光染料
v Primer F/R
引物（上游/下游）
v Template
模板
Mix
第25页/共65页
PCR实验操作注意事项
v冰上操作 v配制混合液 v试剂短暂离心 v防止污染：分区操作 v移液枪：用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性 。
第26页/共65页
PCR反应条件
问题1：无 Ct 值出现
检测荧光 信号的 步骤有 误: 一 般 SG 法采用 72℃ 延伸时 采集。 引物或探 针降解: 可 通过 P AGE电 泳检测 其完整 性。 模板量不 足: 对未知 浓度的 样品应 从系列 稀释样 本的最 高浓度 做起。 模板降解: 避 免样品 制备中 杂质的 引入及 反复冻 融的情 况。
第52页/共65页
问题5：重复性差
1.加样不准确。 2.仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。 3.模板浓度低。样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。
第53页/共65页
问题6：熔解曲线只有上升支
扩增产物 的Tm值 较高， 设置熔 解曲线 时改9 5 度为99 度。
第54页/共65页
95℃，10min； 95℃，15sec， 60℃，30sec， 72℃，30sec， 反应结束后，立即进行溶解f曲or线4分0 析cy。cles
95℃，15sec， 60℃，60sec， 95℃，15sec， 60℃，15sec。
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第28页/共65页
第五部分：数据分析
授发明了具有划时代意义的 PCR技术。
第3页/共65页
PCR Polymerase Chain Reaction
vPCR (聚合酶链式反应)技术是一种体外快速扩 增特定DNA片段的方法。
v 是一个在引物介导下反复进行热变性、退火、 引物延伸三个步骤而扩增DNA的循环过程。
v运用PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的 DNA片段，使皮克(Pg，10－12）起始物达到 微克（μg，10－6）水平。
2 -△△CT
表示实验组目的基因表达相对于对照组变化的倍数。
ΔCt =Ct 目的- Ct 内参 ΔΔCt = ΔCt实验组- ΔCt 对照组
第40页/共65页
第六部分：误差校正
第41页/共65页
模板方面的误差：IPC校正 取样量即细胞数量、抽提效率、纯化损失、 反转录效率等
操作误差：ROX校正 试剂取用误差的主要部分、受耗材质量及仪 器等影响而产生的荧光激发波动
4℃：1周 -20 ℃：1年 -70 ℃：1年以上
DE第P1C5页水/共溶65页解
RNA的质量
RNA得率检测——分光光度计 260nm:核酸 280nm:蛋白等有机体 230nm:杂质浓度 320nm:溶液浑浊度
总RNA浓度（ng/µl） =OD260×40×稀释倍数（ng/µl） OD 260读数介于0.1～1.0之间可靠 （20～3200 ng/µl ）
cDNA为 1： 5 引 物 终 浓 度 50nm
第60页/共65页
问题11：模板降低时，扩增效率低。
cDNA 为 1:5稀 释
cDNA 为 1:10稀 释 cDNA 小 于 PCR反 应 体 积 的10% 。过低 ，扩增 效率低 ；过高 ，增加 非特异 性扩增 ，或者 因反应 抑制物 多，降 低扩增 效率低 。
模板起始 浓度不 相同， 扩增效 率基本 相同。
第58页/共65页
第59页/共65页
问题10：预实验时为单峰，正式时为杂峰。
cDNA为 1： 5 引 物 终 浓 度 100nm
cDNA为 1： 10 引 物 终 浓 度 50nm 引物有问 题：使 用另一 对引物 则为特 异性扩 增。
cDNA为 1： 5 引 物 终 浓 度 100nm
RT引物的选择
是 一 系 列 寡 核苷酸 片段的 混合物 ，它含 有各种 可能的 核苷酸 排列顺 序，因 此可与 任意核 酸序列 杂交。
第21页/共65页
RT反应条件
25℃,5min ；(随机引物加此步) 42℃,60min； 70℃,5min。
第22页/共65页
RT反应的注意事项
冰上操作
所有用具去RNase处理 戴口罩、帽子，勤换手套，防外源RNase污
染 尽量快速 4 ℃离心：室温会导致不适当分层，从而导
致变异RNA产物。
第13页/共65页
RNA的抽提注意事项
一、标本的处理
新鲜、低温保存、避免反复冻融。易至RNA降解，提取量下降。
二RNA；抑制RNase活性；酸性酚使RNA进入
99.0
第55页/共65页
问题7：扩增曲线异常
基线设置 有误。 高浓度的 模板会 导致C T 值过早出现， 即基线 范围变 小，导 致机器 读取荧 光数值 有误。
第56页/共65页
问题8：扩增熔解曲线不同，ct值却相同
模板起始 浓度相 同，扩 增效率 不同。
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问题9：ct值不同，熔解曲线同，扩 增曲线还高
SYBR Green I荧光定量PCR
会计学
1
主要内容
第一部分：PCR简介 第二部分：RNA的提取 第三部分：RT 第四部分：实时荧光定量PCR 第五部分：数据分析 第六部分：误差校正 第七部分：常见问题分析
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第一部分：PCR简介
第2页/共65页
PCR技术的发明
v 1985年教
是一种在PCR反应体系中加入荧 光基团，利用荧光信号积累实 时监测整个PCR进程，最后通过 特定数学原理对未知模板进行 定量分析的方法，实现了PCR从 定性到定量的飞跃。
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实时荧光定量PCR技术分类
荧光探针 Beacon法：以美国人Tagyi为
代表 TaqMan探针:以美国ABI公司
模板量低 。
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问题3：阴性对照有信号
Mix 或水被污染。
如使用R OX 校正，则可能 为R OX 降解所致。
引物二聚 体的出 现：3 5 循环后出现属 正常， 配合熔 解曲线 进行分 析 提 高退火 温度； 降低引 物浓度 ；冰上 操作； 重新设 计引物
第51页/共65页
问题4：溶解曲线不止一个主峰
理论扩增曲线
实际扩增曲线
第31页/共65页
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Tm 值：双链DNA解 链50% 的温度 。
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第38页/共65页
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数据分析：
相对定量：不用得到绝对的拷贝数，只需计算表达差 异即可，得到的结果是某基因表达水平升高了或降 低了多少倍。
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结果：
扩增曲线
熔解曲线
标本
阴性
标本
阴性
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PCR扩增曲线
Rn （Norma lized report er）： 是荧光 报告基 团的荧 光发射 强度与 参比染 料的荧 光发射 强度的 比值。 △ Rn：△ Rn是Rn 扣除基 线后得 到的标 准化结 果（△ Rn=Rn- 基线） 。
配制混合液
试剂短暂离心
移液枪：用完之后要归到最大计量的位 置，防止久而久之弹簧失去弹性 。
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第四部分：实时荧光定量PCR
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SY法-PCR反应基本组分
v DNA Polymerase DNA聚合酶
v dNTP
四种脱氧核苷酸
v Buffer
缓冲溶液
v rox
内参染料
过多：会沉淀盐和其他污染物，使用乙醇不能洗脱。
五、洗涤： 75%乙醇
去盐作用，根据情况可重复几次。
六、溶解： DEPC水
掌握溶解时间。
太早：沉淀物太湿，含有乙醇会影响后续反应。
太迟：沉淀物太干，不易溶解。
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标本
Trizol 氯仿
异丙醇 75%乙醇
4℃：过夜 -70 ℃：一个月
4℃：过夜 -20 ℃：时间长会使盐沉淀
cDN A为1： 5 引 物终浓 100nm
cDN A为1： 5
引物终 浓50nm
引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。
模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组 DNA的引入，或通过引物设计 避免非特异扩增。
其余误差：统计校正
重复实验，取平均第值42页/共65页
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第44页/共65页
第45页/共65页
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总结
设计合格的引物。 适当浓度的模板。 设定内参和阴性对照。 使用合适的ROX。 实验时做复孔。 冰上操作。
第47页/共65页
第七部分：常见问题分 析
第61页/共65页
问题12：未调基线和阈值
峰 型 不 佳 ， 影响ct值 。
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问题13：熔解曲线出现 负值的峰
Sybr green 过 多 抑 制 反应 ？？
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感谢您的观看。
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2.PCR原理
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PCR类型
RT-PCR 兼并引物
PCR 巢式PCR
• 重组PCR • 荧光定量PCR • 锚定PCR • 多重PCR • 定量PCR
……
反向PCR
不对称PCR
原位PCR
第6页/共65页
实时荧光定量PCR技术 real-time fluorescent quantitativePCR FQ-PCR
水相。
过多：上清液变为红色，浪费。
过少：未加氯仿前即分层。
裂解不充分， RNase抑制不充分，得率低，RNA完整性、纯度受损。
三、抽提、分层：氯仿
变性蛋白，抽提去除过多的酚，加速有机相与水相的分层。
过少：上述作用减弱，影响RNA质量。
过多：使DNA和蛋白进入水相，影响RNA质量。
四、沉淀：异丙醇
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问题2： Ct 值出现过晚
扩增效率 低: 反 应条件 不够优 化。设 计更好 的引物 或探针 ；改用 三 步 法进行 反应； 适当降 低退火 温度； 增加镁 离子浓 度等。
PCR 产物太长: 一般采 用 8 0- 150bp 的产物长度。
PCR 各种反应成 分的降 解或加 样量的 不足。
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RNA的质量
第17页/共65页
RNA完整性鉴定
第18页/共65页
第三部分：RT
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RT反应体系
RNA 1μg
Primer 1μL
5×Reaction Buffer
4μL
RNase inhibitor（20U/μL）
1μL
第20页/共65页
10mM dNTP mix
为代表 FRET技术:以罗氏公司为代表
荧光染料 第8页/共65页 饱和荧光染料: EvaGreen、LC
第9页/共65页
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第二部分：RNA的提取
第11页/共65页
提RNA基本步骤 标本
Trizol 氯仿 异丙醇 75%乙醇 DE第P1C2页水/共溶65页解
RNA的抽提注意事项
v SYBR GreenⅠ
荧光染料
v Primer F/R
引物（上游/下游）
v Template
模板
Mix
第25页/共65页
PCR实验操作注意事项
v冰上操作 v配制混合液 v试剂短暂离心 v防止污染：分区操作 v移液枪：用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性 。
第26页/共65页
PCR反应条件