免疫组化操作方法

免疫组化操作方法（SP法、Elivison二步法、ABC法）
一、Elivison二步法
1、石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。

2、取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放
入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS 冲洗2×3’。

（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）
3、每张切片加1滴3%H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。

PBS冲洗3×3’。

4、除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。

5、PBS冲洗3×5’。

除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20分钟。

PBS冲洗3×3’。

6、除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟。

PBS冲洗3×5’。

7、除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液（二氨基联苯胺），显微镜下观察5分钟。

8、苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。

二、SP法
SP（streptavidin-perosidase）法，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。

按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。

按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。

一般的sp法步骤啊，具体如下：
1、烤片，68℃，20分钟，
2、常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I20min⇒二甲苯II20min⇒100%酒精10min⇒100%酒精10min⇒95%酒精5min⇒80%
酒精5min⇒70%酒精5min
3、阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O237℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；
4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快
冷却至室温，PBS冲洗3X5min。

5、正常羊血清工作液封闭，37℃10min，倾去勿洗。

6、滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；
滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗3X5min；
7、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗3X5min；
8、DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，
苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

三、ABC法
1、4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。

蜡块制作。

切片，贴片。

0.01MKPBS清洗5min×3后；
2、加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml+0.01MKPBS 100ml+30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影
响，0.01MPBS清洗5min×3；
3、加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100+0.01MKPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3；
4、加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS 100ml+叠氮纳0.08g）稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS
洗5min×3；
5、加入0.01MKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。

0.01MKPBS洗5min×3；
6、加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；
7、加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马
上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应；
8、梯度酒精脱水之后，封片，拍照。

（该法目前在病理工作中较少应用）
免疫组化，按标记物质的种类，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等；按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等。

SP法细节如下：
1、烤片，68℃，20分钟。

2、常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I20min?二甲苯II20min?100%酒精10min?100%酒精10min?95%酒精5min?80%酒精5min?70%酒精5min。

3、阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O237℃孵育10min，PBS冲洗3X5min。

4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。

5、正常羊血清工作液封闭，37℃10min，倾去勿洗。

6、滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min，PBS 冲洗3X5min。

7、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗3X5min。

8、DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

ABC法细节如下：
1、4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。

蜡块制作。

切片，贴片。

0.01MKPBS清洗5min×3后。

2、加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml+0.01MKPBS 100ml+30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3。

3、加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100+0.01MKPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3。

4、加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS 100ml+叠氮纳0.08g）稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS 洗5min×3。

5、加入0.01MKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。

0.01MKPBS洗5min×3。

6、加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次。

7、加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应。

8、梯度酒精脱水之后，封片，拍照。