焦磷酸测序反应
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PyroMark Q24 Advanced CpG Reagents (4x24)
(Cat. No 970922 for CpG and long sequencing runs)
E-Mix (Enzyme Mix, lyophilized) S-Mix (Substrate Mix, lyophilized) dATPαS (1200µl) dGTP, dCTP, dTTP (660µl, 1 vial each) PyroMark Q24 Advanced Annealing Buffer* PyroMark Q24 Binding Buffer**
室温1400RPM振 摇5~10min
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
样品准备及上机运行
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
程序设计——Assay
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
设计dNTP分配顺序： 点击工具栏 New Assay图标；文件夹右 键>New Assay；File> New Assay; AQ Assay: 等位基因 SNP Assay:核苷酸多态性 CpG Assay：甲基化 SEQ Assay：未知序列测序
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
程序设计——Assay
引物设计
PCR
程序设计
AQ/SNP Assay设计：
Sequence to Analyze; Generate Dispensation Order; Dispensation Order
SEQ Assay 设计：
直接在Dispensation Order 输入
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
仪器、设备和试剂 2
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
PyroMark Q24 Advanced Reagents (4x24)
(Cat. No 970902, for regular sequencing runs)
E-Mix (Enzyme Mix, lyophilized) S-Mix (Substrate Mix, lyophilized) dATPαS (380µl) dGTP, dCTP, dTTP (260µl, 1 vial each) PyroMark Q24 Advanced Annealing Buffer** PyroMark Q24 Binding Buffer*
“Dispensation Order” 3.2设计Run file “Run Name” “Instrument Method” “Assay” “Sample ID (optional)”
4.样品准备 5.运行 6.分析运行结果
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
仪器、设备和试剂 1
引物设计
未知序列 无标准的系统 6h 到几天
焦磷酸测序
精确检测小片段的DNA用于 SNP (或突变)分析 甲基化定性和定量的分析 微生物鉴定
已知序列 (但可能有未知的突变)
商业化的可用试剂盒
~ 30 – 60min
Pyro Q24 Adv 测序的 工作流程
1.引物设计 2.PCR
3.程序设计 3.1设计Assay file “Sequence to Analyze” ”Generate Dispensation Oder”
C
A
G
T
C
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
Байду номын сангаас
A
G
T
C
T
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
PyroMark Assay Design Software 2.0
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
*Ronaghi, M., Uhlén, M., Nyrén, P. (1998) Real-time pyrophosphate detection for DNA sequencing. Science 281:363.
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping 要分析的片断:
a/g C T G C C T
*Ronaghi, M., Uhlén, M., Nyrén, P. (1998) Real-time pyrophosphate detection for DNA sequencing. Science 281:363.
焦磷酸测序简介
light
PPi ATP
time
观看视频
焦磷酸测序简介
光信号的强度与结合的核苷酸数量成正比 没有峰 ̶ 没有结合 1倍高度的峰 ̶ 1个核苷 2倍高度的峰 ̶ 2个核苷 3培高度的峰 ̶ 3个核苷
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
仪器、设备和试剂 3
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
加热器（80℃ 金属浴） 振荡器（1400rpm） PCR仪及相应PCR管 离心机 24孔PCR板或管，及其盖子 超纯水（18.2MΩ或相当） 乙醇（70%） 移液枪（多个量程的） Tip头（无菌，最好有滤芯）
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
C
A
G
T
C
T
G
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
A
G
T
C
T
G
C
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
A
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
A
G
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
A
G
T
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
上机运行
结果分析
3.测序引物与模板结合
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
样品准备及上机运行
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
1.PCR产物固定
1ul/sample
所有试剂应恢复到室温； 珠子吸取前要充分混匀并避免产生气泡； 珠子的优化，建议用1ul； 可先做一个Mix， 每次分装Mix应充分混合； PCR管要干净； PCR产物一般用10~20µl/孔； 要用超纯水将终体积调到80 µl/孔； 盖紧PCR管盖； 体系在被吸取前1min之内必须还在振摇。
主要内容 ❖ 一，焦磷酸测序简介
❖ 二，Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 ❖ 三，仪器维护
焦磷酸测序简介
基于合成的测序（边合成边测序），对DNA 序列进行精确分析和定量分析。
焦磷酸测序反应 体系中有4 种酶
DNA-Polymerase（DNA聚合酶） ATP-Sulfurylase（ATP硫酸化酶） Luciferase（荧光素酶） Apyrase（三磷酸腺苷双磷酸酶） 每次只加一种dNTP（A，T，C，G）
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
A
上机运行
结果分析
C
B
A 菜单栏
D
B 分析窗口
C 分析纵览窗口
D 引物设置区
E 可变位点区
E
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
CpG Assay设计：
Sequence Before Bisulfite Treatment Sequence to Analyze Forward/Reverse Orientation Generate Dispensation Order C 或G 作为转化的control CpN
样品准备
上机运行
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
PCR
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
PCR引物（其中一条有生物素标记）必须 HPLC纯化或相当；
PCR必须高保真，建议PyroMark PCR Kit (200) (cat. no. 978703) ，扩增体系和条件 见右图；
一般用5~20ul扩增物 (Q24 Adv) ；
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Mark Q24 Adv主机 Pyro Mark Q24 真空工作站 Pyro Mark Q24 Adv App software（安装在电脑上） PyroMark Q24 Plate (100) (cat. no. 979201) PyroMark Q24 Cartridge (3) (cat. no. 979202) PyroMark Denaturation Solution (cat. no. 979007) PyroMark Wash Buffer, concentrate (cat. no. 979008) PyroMark PCR Kit (200) (cat. no. 978703) PyroMark Control Oligo（cat.no.979203） 扩增引物和测序引物 葡聚糖珠（Streptavidin Sepharose HP，GE Healthcare #17-5113-01）
C
A
G
T
C
T
G
CT
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T 基因型为 A/G的杂合子
2个半倍峰高的峰
1倍峰高的参考峰
2倍峰高的参考峰
C
A
G
T
阴性对照
C
T
G
CT
参考峰
应用
对象 规则性 时间
传统的测序 vs 焦磷酸测序
传统的测序 整基因组测序 研究未知基因 对DNA大片段测序
Skip
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
按Cartridge 选择
Save 文件copy 到专用U盘中
上机运行
结果分析
Tool>Pre Run information
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
样品准备及上机运行
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
目的：制备单链 DNA模板并结合 测序引物，为测 序作准备
1.PCR产物固定
2.制备单链DNA模板
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
程序设计—— New Run
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
板孔分别用哪个Assay：
File> New Run （或右键） Run Name: 选择Assay：
拖动与“Ctrl+拖动”，选择
填写Sample ID：
拖动与“Ctrl+拖动”
填写Note： Instrument Method:
(Cat. No 970922 for CpG and long sequencing runs)
E-Mix (Enzyme Mix, lyophilized) S-Mix (Substrate Mix, lyophilized) dATPαS (1200µl) dGTP, dCTP, dTTP (660µl, 1 vial each) PyroMark Q24 Advanced Annealing Buffer* PyroMark Q24 Binding Buffer**
室温1400RPM振 摇5~10min
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
样品准备及上机运行
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
程序设计——Assay
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
设计dNTP分配顺序： 点击工具栏 New Assay图标；文件夹右 键>New Assay；File> New Assay; AQ Assay: 等位基因 SNP Assay:核苷酸多态性 CpG Assay：甲基化 SEQ Assay：未知序列测序
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
程序设计——Assay
引物设计
PCR
程序设计
AQ/SNP Assay设计：
Sequence to Analyze; Generate Dispensation Order; Dispensation Order
SEQ Assay 设计：
直接在Dispensation Order 输入
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
仪器、设备和试剂 2
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
PyroMark Q24 Advanced Reagents (4x24)
(Cat. No 970902, for regular sequencing runs)
E-Mix (Enzyme Mix, lyophilized) S-Mix (Substrate Mix, lyophilized) dATPαS (380µl) dGTP, dCTP, dTTP (260µl, 1 vial each) PyroMark Q24 Advanced Annealing Buffer** PyroMark Q24 Binding Buffer*
“Dispensation Order” 3.2设计Run file “Run Name” “Instrument Method” “Assay” “Sample ID (optional)”
4.样品准备 5.运行 6.分析运行结果
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
仪器、设备和试剂 1
引物设计
未知序列 无标准的系统 6h 到几天
焦磷酸测序
精确检测小片段的DNA用于 SNP (或突变)分析 甲基化定性和定量的分析 微生物鉴定
已知序列 (但可能有未知的突变)
商业化的可用试剂盒
~ 30 – 60min
Pyro Q24 Adv 测序的 工作流程
1.引物设计 2.PCR
3.程序设计 3.1设计Assay file “Sequence to Analyze” ”Generate Dispensation Oder”
C
A
G
T
C
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
Байду номын сангаас
A
G
T
C
T
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
PyroMark Assay Design Software 2.0
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
*Ronaghi, M., Uhlén, M., Nyrén, P. (1998) Real-time pyrophosphate detection for DNA sequencing. Science 281:363.
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping 要分析的片断:
a/g C T G C C T
*Ronaghi, M., Uhlén, M., Nyrén, P. (1998) Real-time pyrophosphate detection for DNA sequencing. Science 281:363.
焦磷酸测序简介
light
PPi ATP
time
观看视频
焦磷酸测序简介
光信号的强度与结合的核苷酸数量成正比 没有峰 ̶ 没有结合 1倍高度的峰 ̶ 1个核苷 2倍高度的峰 ̶ 2个核苷 3培高度的峰 ̶ 3个核苷
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
仪器、设备和试剂 3
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
加热器（80℃ 金属浴） 振荡器（1400rpm） PCR仪及相应PCR管 离心机 24孔PCR板或管，及其盖子 超纯水（18.2MΩ或相当） 乙醇（70%） 移液枪（多个量程的） Tip头（无菌，最好有滤芯）
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
C
A
G
T
C
T
G
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
A
G
T
C
T
G
C
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
A
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
A
G
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
A
G
T
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
上机运行
结果分析
3.测序引物与模板结合
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
样品准备及上机运行
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
1.PCR产物固定
1ul/sample
所有试剂应恢复到室温； 珠子吸取前要充分混匀并避免产生气泡； 珠子的优化，建议用1ul； 可先做一个Mix， 每次分装Mix应充分混合； PCR管要干净； PCR产物一般用10~20µl/孔； 要用超纯水将终体积调到80 µl/孔； 盖紧PCR管盖； 体系在被吸取前1min之内必须还在振摇。
主要内容 ❖ 一，焦磷酸测序简介
❖ 二，Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 ❖ 三，仪器维护
焦磷酸测序简介
基于合成的测序（边合成边测序），对DNA 序列进行精确分析和定量分析。
焦磷酸测序反应 体系中有4 种酶
DNA-Polymerase（DNA聚合酶） ATP-Sulfurylase（ATP硫酸化酶） Luciferase（荧光素酶） Apyrase（三磷酸腺苷双磷酸酶） 每次只加一种dNTP（A，T，C，G）
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
A
上机运行
结果分析
C
B
A 菜单栏
D
B 分析窗口
C 分析纵览窗口
D 引物设置区
E 可变位点区
E
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
CpG Assay设计：
Sequence Before Bisulfite Treatment Sequence to Analyze Forward/Reverse Orientation Generate Dispensation Order C 或G 作为转化的control CpN
样品准备
上机运行
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
PCR
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
PCR引物（其中一条有生物素标记）必须 HPLC纯化或相当；
PCR必须高保真，建议PyroMark PCR Kit (200) (cat. no. 978703) ，扩增体系和条件 见右图；
一般用5~20ul扩增物 (Q24 Adv) ；
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
Pyro Mark Q24 Adv主机 Pyro Mark Q24 真空工作站 Pyro Mark Q24 Adv App software（安装在电脑上） PyroMark Q24 Plate (100) (cat. no. 979201) PyroMark Q24 Cartridge (3) (cat. no. 979202) PyroMark Denaturation Solution (cat. no. 979007) PyroMark Wash Buffer, concentrate (cat. no. 979008) PyroMark PCR Kit (200) (cat. no. 978703) PyroMark Control Oligo（cat.no.979203） 扩增引物和测序引物 葡聚糖珠（Streptavidin Sepharose HP，GE Healthcare #17-5113-01）
C
A
G
T
C
T
G
CT
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T 基因型为 A/G的杂合子
2个半倍峰高的峰
1倍峰高的参考峰
2倍峰高的参考峰
C
A
G
T
阴性对照
C
T
G
CT
参考峰
应用
对象 规则性 时间
传统的测序 vs 焦磷酸测序
传统的测序 整基因组测序 研究未知基因 对DNA大片段测序
Skip
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
按Cartridge 选择
Save 文件copy 到专用U盘中
上机运行
结果分析
Tool>Pre Run information
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
样品准备及上机运行
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
目的：制备单链 DNA模板并结合 测序引物，为测 序作准备
1.PCR产物固定
2.制备单链DNA模板
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
程序设计—— New Run
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
板孔分别用哪个Assay：
File> New Run （或右键） Run Name: 选择Assay：
拖动与“Ctrl+拖动”，选择
填写Sample ID：
拖动与“Ctrl+拖动”
填写Note： Instrument Method: