多克隆抗体制备ppt课件
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制备抗哺乳动物蛋白 质的抗体具有独特的优点。
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物 的Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下, 鸡IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内 可保持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏 条件下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和 单价的Fab或Fab′等片段。
(三) 效应阶段(effective stage) 此阶段是由活化的效应细胞(CTL 与 TD 或 TDTH)和效应分子(抗体与细胞因子)发挥细胞免疫效应和体液免疫效应的 过程。这些效应细胞和效应分子共同作用清除抗原异物。
多克隆抗体制备
多克隆抗体制备
初次应答(primary response)
机体初次接受适量的抗原刺激后，引起体内抗体产生的过程 称为初次应答，主要特点为： ①机体初次接触抗原后，需经一定的潜伏期血清中才能出现 抗体，潜伏期的长短取决于抗原的性质、抗原进入机体的途 径、所用的佐剂类型、受体情况等，潜伏期之后为抗体的对 数上升期，抗体含量直线上升，然后为持续期，抗体产生和 排出相对平衡，最后为下降期； ②初次应答最早产生的抗体为 IgM，可在几天内达到高峰， 然后开始下降，接着才产生 IgG，IgG 抗体产生的潜伏期比 IgM 长，如果抗原剂量少，可能仅产生 IgM，IgA 产生最迟， 而且含量少； ③初次应答产生的抗体总量较低，维持时间也短，通常以 IgM 为主，且抗体的平均亲和力较低。
多克隆抗体制备
再次应答(secondary response)
机体再次接触相同的抗原时，体内产生抗体的过程 称为再次应答或回忆应答(anamnestic response)，主 要特点为：
①潜伏期显著缩短，约为初次应答潜伏期的一半；
②抗体含量大幅度上升，比初次应答多几倍到几十 倍，而且维持时间长；
多克隆抗体制备
多克隆抗体制备
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体制备
动物选择
一、选择制备多克隆抗体(抗血清)的动物种类应考虑 的要点: •需要制备的抗血清的质量; •供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种系关系; •免疫动物产生的抗体特性（针对不同性质的免疫原 选用相应的动物）。 二、动物的年龄、性别和数量对抗体制备的影响 •优先选取青壮年动物； •雌性动物的免疫应答状况,无论是细胞性还是体液性 免疫都比雄性个体强烈。
免疫原；
• 乳化：一般抗（原6与）改免变疫抗佐体剂的体产积生类比型1:以1混及合产生。迟首发次 免疫采用完全型佐变剂态，反加应强，并免使疫其采增用强不。完全佐剂。
多克隆抗体制备
免疫方式
• 注射途径：免疫注射的途径也很重要。一般采用 多点注射，一只动物注射总数约为8～10点，包括 足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后 等处皮内或皮下，皮内易引起细胞免疫反应，对 提高抗体效价有利
多克隆抗体制备
免疫方式
• 间隔与免疫时间：第一次免疫后，因动物机体正 处于识别抗原和b细胞增殖阶段，如很快接着第二 次注入抗原，极易造成免疫抑制。一般以间隔 10～20天为好。二次以后每次的间隔一般为7～10 天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。
• 免疫次数：根据抗体效价要求确定（抗血清滴度 测定）
多克隆抗体制备
家兔
家兔是最适合制备抗体的动物。 •其体型适中,成年体重为2～6kg,一次采血量可达 25～50ml,全放血量则达100～180ml; •性格驯顺,易于操作和采血; •寿命相对较长,为5～8年; •能生产足够量的高效价和高亲和力的抗血清； •通常适用于制备抗啮齿类和人蛋白质的抗体； •家兔仅一型IgG而无亚型。用家兔的IgG很容易制备 Fc、Fab和F(ab′)2等片段
多克隆抗体制备
免疫应答
机体免疫系统受到抗原刺激后，免疫细胞发生一系列变化，并产生一定 免疫效应的过程。
(一) 感应阶段(inductive stage) 称致敏阶段(sensitization stage)，是抗原物 质进入体内，抗原递呈细胞(APC)对其识别、捕获、加工处理和递呈，以 及抗原特异性淋巴细胞(T 细胞和 B 细胞)对抗原的识别阶段。
鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体 可避免采用损伤性的收集手段。
多克隆抗体制备
免疫剂量
（1）延长抗原释放时间；
• 剂量：免疫原（合2适）增剂加量抗的原选的定表应面积考；虑抗原性强弱、 分子量大小和（免3疫）佐时剂间能。刺大激动吞物噬细抗胞原对剂抗量原（的以处理蛋； 白抗原为准）（约40）.5增～强1辅m助g/T只细，胞的小作动用物；约0.1～ 0.6mg/只。如（无5）免刺疫激佐致剂敏可淋适巴细当胞提的高分免裂疫和剂浆量细胞 （10-20倍）。产生抗体。使无免疫原性物质变成有效的
③诱发再次应答所需的抗原剂量极小；
④再次应答产生的抗体主要为 IgG，而 IgM很少， 抗体的平均亲和力高。如果再次应答间隔的时间越 长，机体越倾向于只产生 IgG。抗原物质如经消化 道和呼吸道等粘膜途径进入机体，可诱导产生分泌 型 IgA，在粘膜表面发挥多克隆免抗体疫制备效应。
血液采集
采血量
采血部位
少量
尾静脉，耳静脉，眼 底静脉
中量
耳中央动脉，颈动/静 脉，心脏
大量
股动脉，颈动脉，心 脏，摘眼球
血清的分离：采取4℃静置过夜，3000-4000 转离心10-15min钟。
多克隆抗体制备
( 二) 增生分化阶段(proliferative and differentiative stage) 又称反应阶段 (reactive stage)，是抗原特异性淋巴细胞识别抗原后活化，进行增殖与分 化，以及产生效应性淋巴细胞和效应分子的过程。T 细胞增殖分化为淋 巴母细胞，最终成为效应 T 细胞(或称致敏 T 细胞)，并产生多种细胞因 子；B 细胞增殖分化为浆细胞，合成并分泌抗体。一部分 T、B 淋巴细胞 在分化过程中成为记忆细胞(Bm 和 Tm)。在此阶段，有多种细胞间的协 作和多种细胞因子的参加。
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物 的Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下, 鸡IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内 可保持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏 条件下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和 单价的Fab或Fab′等片段。
(三) 效应阶段(effective stage) 此阶段是由活化的效应细胞(CTL 与 TD 或 TDTH)和效应分子(抗体与细胞因子)发挥细胞免疫效应和体液免疫效应的 过程。这些效应细胞和效应分子共同作用清除抗原异物。
多克隆抗体制备
多克隆抗体制备
初次应答(primary response)
机体初次接受适量的抗原刺激后，引起体内抗体产生的过程 称为初次应答，主要特点为： ①机体初次接触抗原后，需经一定的潜伏期血清中才能出现 抗体，潜伏期的长短取决于抗原的性质、抗原进入机体的途 径、所用的佐剂类型、受体情况等，潜伏期之后为抗体的对 数上升期，抗体含量直线上升，然后为持续期，抗体产生和 排出相对平衡，最后为下降期； ②初次应答最早产生的抗体为 IgM，可在几天内达到高峰， 然后开始下降，接着才产生 IgG，IgG 抗体产生的潜伏期比 IgM 长，如果抗原剂量少，可能仅产生 IgM，IgA 产生最迟， 而且含量少； ③初次应答产生的抗体总量较低，维持时间也短，通常以 IgM 为主，且抗体的平均亲和力较低。
多克隆抗体制备
再次应答(secondary response)
机体再次接触相同的抗原时，体内产生抗体的过程 称为再次应答或回忆应答(anamnestic response)，主 要特点为：
①潜伏期显著缩短，约为初次应答潜伏期的一半；
②抗体含量大幅度上升，比初次应答多几倍到几十 倍，而且维持时间长；
多克隆抗体制备
多克隆抗体制备
多克隆抗体的制备方法
多克隆抗体制备
动物选择
一、选择制备多克隆抗体(抗血清)的动物种类应考虑 的要点: •需要制备的抗血清的质量; •供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种系关系; •免疫动物产生的抗体特性（针对不同性质的免疫原 选用相应的动物）。 二、动物的年龄、性别和数量对抗体制备的影响 •优先选取青壮年动物； •雌性动物的免疫应答状况,无论是细胞性还是体液性 免疫都比雄性个体强烈。
免疫原；
• 乳化：一般抗（原6与）改免变疫抗佐体剂的体产积生类比型1:以1混及合产生。迟首发次 免疫采用完全型佐变剂态，反加应强，并免使疫其采增用强不。完全佐剂。
多克隆抗体制备
免疫方式
• 注射途径：免疫注射的途径也很重要。一般采用 多点注射，一只动物注射总数约为8～10点，包括 足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后 等处皮内或皮下，皮内易引起细胞免疫反应，对 提高抗体效价有利
多克隆抗体制备
免疫方式
• 间隔与免疫时间：第一次免疫后，因动物机体正 处于识别抗原和b细胞增殖阶段，如很快接着第二 次注入抗原，极易造成免疫抑制。一般以间隔 10～20天为好。二次以后每次的间隔一般为7～10 天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。
• 免疫次数：根据抗体效价要求确定（抗血清滴度 测定）
多克隆抗体制备
家兔
家兔是最适合制备抗体的动物。 •其体型适中,成年体重为2～6kg,一次采血量可达 25～50ml,全放血量则达100～180ml; •性格驯顺,易于操作和采血; •寿命相对较长,为5～8年; •能生产足够量的高效价和高亲和力的抗血清； •通常适用于制备抗啮齿类和人蛋白质的抗体； •家兔仅一型IgG而无亚型。用家兔的IgG很容易制备 Fc、Fab和F(ab′)2等片段
多克隆抗体制备
免疫应答
机体免疫系统受到抗原刺激后，免疫细胞发生一系列变化，并产生一定 免疫效应的过程。
(一) 感应阶段(inductive stage) 称致敏阶段(sensitization stage)，是抗原物 质进入体内，抗原递呈细胞(APC)对其识别、捕获、加工处理和递呈，以 及抗原特异性淋巴细胞(T 细胞和 B 细胞)对抗原的识别阶段。
鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体 可避免采用损伤性的收集手段。
多克隆抗体制备
免疫剂量
（1）延长抗原释放时间；
• 剂量：免疫原（合2适）增剂加量抗的原选的定表应面积考；虑抗原性强弱、 分子量大小和（免3疫）佐时剂间能。刺大激动吞物噬细抗胞原对剂抗量原（的以处理蛋； 白抗原为准）（约40）.5增～强1辅m助g/T只细，胞的小作动用物；约0.1～ 0.6mg/只。如（无5）免刺疫激佐致剂敏可淋适巴细当胞提的高分免裂疫和剂浆量细胞 （10-20倍）。产生抗体。使无免疫原性物质变成有效的
③诱发再次应答所需的抗原剂量极小；
④再次应答产生的抗体主要为 IgG，而 IgM很少， 抗体的平均亲和力高。如果再次应答间隔的时间越 长，机体越倾向于只产生 IgG。抗原物质如经消化 道和呼吸道等粘膜途径进入机体，可诱导产生分泌 型 IgA，在粘膜表面发挥多克隆免抗体疫制备效应。
血液采集
采血量
采血部位
少量
尾静脉，耳静脉，眼 底静脉
中量
耳中央动脉，颈动/静 脉，心脏
大量
股动脉，颈动脉，心 脏，摘眼球
血清的分离：采取4℃静置过夜，3000-4000 转离心10-15min钟。
多克隆抗体制备
( 二) 增生分化阶段(proliferative and differentiative stage) 又称反应阶段 (reactive stage)，是抗原特异性淋巴细胞识别抗原后活化，进行增殖与分 化，以及产生效应性淋巴细胞和效应分子的过程。T 细胞增殖分化为淋 巴母细胞，最终成为效应 T 细胞(或称致敏 T 细胞)，并产生多种细胞因 子；B 细胞增殖分化为浆细胞，合成并分泌抗体。一部分 T、B 淋巴细胞 在分化过程中成为记忆细胞(Bm 和 Tm)。在此阶段，有多种细胞间的协 作和多种细胞因子的参加。