微波辐射后大鼠肺组织中VEGF和AQP5的表达变化

微波辐射后大鼠肺组织中VEGF和AQP5的表
达变化
作者：董红艳，胡向军，彭瑞云，王水明
【摘要】目的探讨微波辐射后大鼠肺组织中VEGF和AQP5的表达及其意义。

方法采用10、30 和100 mW/cm2 的微波辐射96只二级Wistar 雄性大鼠，于辐射后6 h、1 d、3 d、7 d和14 d取肺组织，采用免疫组织化学和图象分析技术探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）和水通道蛋白5（aquaporin5，AQP5）在辐射后大鼠血气屏障(blood air barrier)改变中的作用。

结果（1）大鼠肺组织中VEGF表达变化：假辐射组VEGF见于血管内皮细胞浆,呈弱阳性表达。

30、100 mW/cm2组微波辐射后6 h～7 d， VEGF于血管内皮细胞浆呈阳性表达，6 h即见增加，1 d 达高峰，3、7 d也呈阳性表达，14 d恢复至正常。

图象分析结果显示，6 h～7 d与假辐射组相比有显著性差异（p＜或p＜），且上述改变与辐射剂量呈正相关；（2）大鼠肺组织中AQP5表达改变：AQP5在假辐射组Ⅰ型肺泡上皮细胞膜呈阳性分布，上述三组在辐射后Ⅰ型肺泡上皮细胞膜AQP5的表达均减弱，其中100 mW/cm2 组减弱最明显，1 d呈弱阳性，3 d见恢复，7 d基本恢复至正常。

结论 10～100 mW/cm2 的微波辐射可使VEGF表达增加，AQP5表达减少，并且有时效性和量效性关系，二者可能参与了微波辐射致血气屏障损伤
的病理生理过程。

【关键词】微波；大鼠；肺； VEGF； AQP5
The express changes of VEGF and AQP5 of rat lung after
Abstract: Objective To investigate VEGF（vascular endothelial growth factor） and AQP5（aquaporin5） changes of rat lung after microwave radiation. Methods 96 rats were exposed to microwave which average power densities were 10, 30 and 100 mW/cm2 respectively and killed on 6 h, 1 d, 3 d, 7 d and 14 d after radiation. Apply immunohistochemistry and image analysis to approach the effect of VEGF and AQP5 of rat blood air barrier after microwave radiation. Results (1) The change of VEGF in rat lung: In sham radiation group VEGF weakly positive appeared in kytoplasm of vascular endothelial cell. After 30, 100 mW/cm2 microwave radiation, 6 h～7 d VEGF expressed positive in kytoplasm of vascular endothelial cell. At 6 h VEGF were increased more in radiation group than in sham radiation group and expressed most positive on 1 d and on 3 d, 7 d were also expressed positive and recovered on 14 d.
Image analysis showed that on 6 h～7 d the VEGF had significant difference (P＜or P＜）and had direct correlation with quantity of radiation. (2) The change of AQP5 in rat lung: In sham radiation group AQP5 positive appeared on the cellular membrane of typeⅠalveolar epithelial cell. AQP5 were decreased after microwave radiation in 10, 30 and 100 mW/cm2 groups. In 100 mW/cm2 group, AQP5 were weakly positive on 1 d, gradually recovered after 3 d, turned mainly normal at 7 d. Conclusion 10～100 mW/cm2 microwave radiation can change VEGF and AQP5 quantity of rat blood air barrier and these changes had positive correlation with radiation quantity. VEGF and AQP5 possible participated the pathological physiological impaired process of microwave radiation on rat blood air barrier.
Key words: microwave; rat; lung; VEGF; AQP5
微波技术被广泛应用于工业、医疗、通讯等领域，其所引起的生物学效应越来越受到关注。

肺脏是微波辐射的敏感靶器官之一［1］。

本研究通过VEGF和 AQP5在大鼠肺组织中的动态表达，观察不同功率密度微波辐射对肺脏血气屏障的影响，探讨其时效和量效关系，为阐明微波辐射后肺组织生物效应以及机制提供依据。

1 材料与方法
材料二级雄性Wistar大鼠30只，体重180±20 g，由军事医学科学院实验动物中心提供；VEGF、 AQP5购于武汉博士德生物工程有限公司；DAB显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司；CMIASⅡ系列多功能真彩色病理图像分析系统（Leica公司）。

方法
动物分组与辐射方法
上述大鼠随机分为假辐射组和10、30和100 mW/cm2辐射组，每组6只动物。

辐射方法采用微波模拟源进行全身均匀辐射，平均功率密度分别为10、30和100 mW/cm2，辐射时间均为5 min。

假辐射组仅将装有大鼠的辐射盒放于辐射台上，不进行辐射。

大鼠肺组织取材及处理
各组大鼠分别于辐射后6 h及1、3、7和14 d活杀取材，取左叶肺组织置于10%缓冲福尔马林溶液中固定1w，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸腊，石蜡包埋，切片5 μm。

免疫组织化学染色
将切片贴于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，进行免疫组织化学染色。

实验步骤参照文献［2］报道加以改进，主要步骤如下：1. 二甲苯脱蜡至水； 3% H2O2室温孵育10 min；枸橼酸（ mmol/L, ）中微波修复；血清封闭30 min；一抗（工作浓度VEGF 1∶200、 AQP5 1∶100），置于湿盒37℃ 60 min后，4℃过夜；加Bio羊抗兔IgG （1∶200），37℃ 40 min；加HRP SA（1∶200），37℃ 30 min；DAB显色，镜下控制显色效果；充分水洗，苏木素浅染细胞核，脱水，透明，封片，镜检。

对照实验用PBS代替一抗作阴性对照，其余步骤同上。

图像分析
在光镜10×40倍视野下，应用CMIASⅡ图象分析仪对上述肺组织切片进行平均光密度(MOD)和积分光密度（IOD）测定及分析，每只动物的5张切片分别随机选取 5个视野。

统计学处理
结果以组以均数±标准差（±s）表示，采用SAS 统计软件进行单因素多水平检验。

* P＜为差异有统计学意义，** P＜为差异有
显著统计学意义。

2 结果
VEGF免疫组化学染色结果假辐射组VEGF见于血管内皮细胞浆,棕黄色颗粒呈弱阳性表达（图1a）；30、100 mW/cm2组微波辐射后1 d～7 d， VEGF于血管内皮细胞浆棕黄色颗粒呈阳性表达，6 h 较假辐射组表达增加，1 d表达最强（图1b），3、7 d也呈阳性表达，14 d恢复至正常。

图象分析结果显示，1 d～7 d与假辐射组相比有显著性差异（p＜或p＜）且上述改变与辐射剂量呈正相关，见表1。

表1 微波辐射后大鼠肺组织中VEFG平均光密度（MOD）结果(×10-2)注：与假辐射组比较，* P＜，** P＜。

图1 大鼠肺组织VEGF的表达 (SP ×200) a. 假辐射组，示VEGF于肺微血管内皮细胞浆中呈棕黄色颗粒弱阳性分布。

b. 100 mW/cm2 辐射后1 d，示VEGF于肺微血管内皮细胞浆中呈棕黄色颗粒强阳性分布。

图2 大鼠肺组织中AQP5表达（SP ×400 ）
a. 假辐射组，示AQP5于Ⅰ型肺泡上皮细胞膜上棕黄色颗粒呈阳性分布。

b. 100 mW/cm2 微波辐射后1 d，示AQP5于Ⅰ型肺泡上皮细胞膜上棕黄色颗粒呈弱阳性分布。

AQP5免疫组化学染色结果
AQP5在假辐射组Ⅰ型肺泡上皮细胞膜上呈阳性分布（图2a），上述三组在辐射后Ⅰ型肺泡上皮细胞膜AQP5的表达均减弱，其中100 mW/cm2 组减弱最明显，1 d呈弱阳性(图2b)，3 d见恢复，7 d基本恢复至正常。

定量分析结果见表2。

表2 微波辐射后大鼠肺组织AQP5平均光密度（MOD）结果(×10-2) 注：与假辐射组比较，* P＜。

3 讨论
随着广播、电视、通讯及电力事业的迅速发展，信息传输和各种家用电器已经成为人们生活不可缺少的部分，但也使整个生物界处在微波辐射之中，微波对生物体的影响日益受到重视［3，4］。

目前普遍认为，中枢神经系统、免疫系统、循环系统等是微波生物效应的敏感部位。

微波对肺脏作用的研究，主要集中在放射性肺炎，有学者认为肺脏是微波损伤的敏感靶器官之一［1］。

黄小军等［5］对高功率微波辐射后的大鼠肺组织结构进行了观察发现：肺上皮细胞变性严重，肺泡隔断裂、变薄，出现广泛的肺大泡；间质水肿，炎细胞浸润，肺内小静脉淤血。

并且有学者观察到一定条件的微波辐射可引起血—脑屏障和血—睾屏障的结构和功能改变，其中主要的病理改变是水肿和出血［6，7］。

但国内外对微波辐射引起的肺水肿和出血的机制鲜有报道，为此，本文就引起肺组织水肿和出血的两个重要因子VEGF
和AQP5进行了研究。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）既是一种生长因子，又是一种通透因子，具有促进血管通透性增高，血管内皮细胞分裂、增殖，诱导血管生成以及细胞质钙聚集等作用［8］。

肺泡、支气管上皮细胞、支气管腺细胞和激活的巨噬细胞等都能合成VEGF，其中最主要的是II型肺泡上皮细胞，Kaner等［9］的研究表明，正常人的呼吸道上皮黏液中VEGF的含量是血清中的500倍，不直接释放入血，当肺泡气血屏障的完整性遭到破坏时，呼吸上皮侧的高浓度VEGF可直接向血液释放。

Robert［10］和Antonetti ［11］的研究表明，VEGF通过其受体能够使Occludin在细胞内的结构磷酸化，可导致Occludin从内皮细胞膜上脱落或者蛋白降解，从而影响内皮细胞之间的紧密连接，引起内皮和微血管通透性增加。

在体外培养脐静脉中发现，TNFα可完全消除VEGF导致的内皮细胞合成，TNFα过度表达转基因动物除发生肺气肿外，还伴有其受体表达下降［12］。

VEGF在微波辐射致肺损伤中的机制未见报道，为此，本研究采用免疫组织化学方法观察VEGF在微波辐射后大鼠肺组织中的动态变化规律。

发现VEGF在微波辐射后于血管内皮细胞浆呈阳性表达，图象分析结果显示，阳性改变与辐射剂量呈正相关。

水通道蛋白(AQPs)通过肺泡上皮促进水转运，并且在生理或病理状态下均对呼吸系统水的平衡起到重要作用。

但长期以来均认为水通过细胞膜的转运是以简单扩散的方式，直到1988年Agre在提纯红细胞时发现了28KD通道构成整合膜蛋白［13］，证实了水转运的另一种形式：通道介导的水转运。

AQPs在肺组织中表达的研究在国内外均刚刚起步，研究结果尚无定论，至今在哺乳动物已发现10种水通道(AQP0～AQP9)，它们都有增加浆膜面水通透的功能。

目前确认在肺组织中有4种水通道(AQP1、AQP3、AQP4、AQP5),有研究表明，AQP1表达在微血管上皮和肺细胞，AQP4位于气道上皮的基膜上，AQP5在Ⅰ肺泡型细胞上有表达［14］， AQP3广泛存在于小气道及远端气道上皮且在肺泡各型细胞上均有表达［15］。

国内外水通道在呼吸系统发病机制的研究都刚刚起步，对肺组织水通道还没有统一的认识及定论，肺组织水通道在体内的分布、调节、生理和病理状态下的作用均有待进一步研究，随着对AQPs的深入研究，不仅可对细胞膜水转运提供分子解释，而且还将对人类某些疾病如肺水肿、哮喘、ARDS等的发病机制进一步认识，可能会有理论上的突破。

AQP5在微波辐射致肺损伤中的机制亦未见报道，本研究采用免疫组织化学方法观察AQP5在微波辐射后大鼠肺组织中的动态变化规律。

观察到辐射后Ⅰ型肺泡上皮细胞膜AQP5的表达均减弱，并且与辐射剂量有时效和量效关系。

综上，10、30 和100 mW/cm2 的微波辐射后可使VEGF表达增加，AQP5表达减少，并且有时效性和量效性关系，二者可能参与了微波致血—气屏障损伤的病理生理过程。

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