固相萃取_高效液相色谱法检测牛奶和猪肉中5种_内酰胺类抗生素

固相萃取2高效液相色谱法
检测牛奶和猪肉中5种β2内酰胺类抗生素
叶能胜,谷学新Ξ,张　琦
(首都师范大学化学系,北京100048)
摘　要:建立了牛奶和猪肉样品中氨苄西林、青霉素V、青霉素G、苯唑西林和氯唑西林等5种β2内酰胺类抗生素残留量的高效液相色谱(HP LC)测定方法。

实验采用固相萃取法(SPE)富集抗生素残留,考察了样品前处理方法;并对色谱分离条件加以优化,在C
18色谱柱上以乙腈2011%氨水进行梯度洗脱,可在10min内实现5种抗生素的分离与检测,检测波长为210nm。

方法可用于动物性食品中上述抗生素残留的同时检测。

关键词:β2内酰胺类抗生素;高效液相色谱法;固相萃取;牛奶;猪肉
中图分类号:O657.7 文献标识码:A 文章编号:100020720(2010)062073205
β2内酰胺类抗生素是含有β2内酰胺基母核结构的一类抗生素。

在动物饲养中,β2内酰胺类抗生素广泛用于治疗动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等,如果使用不当或不遵守休药期规定,均可能造成此类抗生素在动物性食品中的显著残留,给人的健康带来危害。

因此,有必要建立动物性食品中的β2内酰胺类抗生素残留分析方法。

K antiani 及Samanidou分别就有关β2内酰胺类抗生素分析方法加以评述[1,2],本课题组也就这一领域的最新进展加以综述[3],还实现了毛细管电泳法快速分离并测定牛奶中4种β2内酰胺类抗生素[4]。

在近期文献报道中,高效液相色谱法(HP LC)及液质联用技术是分析β2内酰胺类抗生素的常用方法[5～8],包括使用衍生化方法来提高方法灵敏度和特异性[9,10]。

本文建立了固相萃取2高效液相色谱法(SPE2HP LC)同时测定猪肉和牛奶中5种β2内酰胺类抗生素残留量,方法无需衍生化,简便快捷。

1　实验部分
1.1　仪器和试剂
1200Series高效液相色谱仪(Agilent公司),配有真空脱气、四元泵、二极管阵列检测器和自动进样器。

Visiprep D L SPE型固相萃取装置(S UPE L2 C O公司);不同类型的固相萃取柱购自Waters公司和Agilent公司,分别是Waters Oasis H LB (6m L)、Waters Oasis MAX(6m L)和Agilent Bond ODS C18(6m L)。

氨苄西林(Am picillin,AMPI)、青霉素V(Peni2 cillin V,PE NV)标准品购自中国药品生物制品检定所,青霉素G(Penicillin G,PE NG)、苯唑西林(Ox2 acillin,OX AC)、氯唑西林(Cloxacillin,C LOX)购自Sigma公司;乙腈(AC N,色谱纯)、甲醇(色谱纯)购自Merck公司,其他试剂均为国产分析纯。

实验用水均通过Milli2Q超纯水器制备(Millipore公司)。

1.2　标准溶液的配制
准确称取5种β2内酰胺类抗生素标准品各10mg,用10m L V(水)∶V(AC N)=1∶1溶解,配制成110mgΠm L的标准储备液,于4℃冰箱中避光保存,储存时间为1个月。

标准品工作溶液均由储备液逐级稀释而成,当天使用。

所有溶液使用前均通过0.45μm微孔滤膜。

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Ξ收稿日期:2009209221;修订日期:2009211220
基金项目:北京市教委科技发展(K M200710028010)项目资助
作者简介:叶能胜(1975-),男,讲师;E2mail:guxuexin@
1.3　样品处理
1.3.1　猪肉样品前处理　称取510g切碎的猪肉置于25m L离心管中(若为加标样品,则加入适量的混合标准品溶液),加入10m L体积分数为015%乙酸250gΠL钨酸钠的混合提取液,混匀器振荡混匀1min。

向溶液中加入10m L正己烷,振荡1min,取下离心15min(4000rΠmin)。

弃去上层正己烷及油层,转移下层清液准备进行固相萃取。

先将固相萃取柱用5m L甲醇和5m L水预处理,将提取液过SPE柱,控制流速1～2m LΠmin,再用5m L含体积分数5%甲醇淋洗;淋洗完毕,用5m L 甲醇洗脱,萃取柱在真空条件下保持1min,使其中的液体完全流出。

收集到的洗脱液在40℃下用N2吹干,用水定容,经0145μm滤膜过滤后进行HP LC分析。

1.3.2　牛奶样品前处理　准确吸取
2.50m L空白牛奶试样置于离心管中(若为加标样品,则加入适量的混合标准品溶液),加入10m L AC N,振荡混合1min,离心15(4000rΠmin)。

转移上层清液,离心后的牛奶样品再加入2.0m L AC N,重复上述过程。

合并上层清液,加水1m L,40℃下用N2吹至0.5～1.0m L,加水10m L振荡混匀,所得溶液采用与猪肉样品相同的固相萃取方法加以富集并进行HP LC检测。

1.4　高效液相色谱分析
色谱柱:Agilent extend C
18色谱柱(250mm×416mm,5μm);流动相:A:011%NH3・H2O溶液, B:AC N;流动相流速:110m LΠmin;柱温:35℃;
进样量:20μL;梯度条件:0min V(NH
3・H2O)∶V(AC N)=95∶5,10min V(NH3・H2O)∶V(AC N)= 70∶30,16min V(NH3・H2O)∶V(AC N)=40∶60。

2　结果与讨论
2.1　色谱分离条件
实验分别考察了甲酸2AC N和氨水2AC N2种流动相体系对5种抗生素分离的影响。

采用0105%、011%和012%甲酸2AC N作流动相时,选用Agilent Z ebra S B酸性柱为色谱柱,发现基线漂移严重,而且分析物吸收信号不强;采用0105%
氨水2AC N做流动相时,选用Agilent Extend C
18色谱柱,基线略有漂移,但影响不大,分析物吸收信号较强,5种物质得到基线分离。

进一步优化流动相体系中氨水的比例(011%,012%和013%),发现氨水体积分数在011%时,待分析物的峰形和分离度最佳。

故实验中选择体积分数011%NH
3・H2O
溶液和乙腈为流动相,同时选用Agilent Extend C
18色谱柱。

随后进一步考察了梯度洗脱和等度洗脱两种不同的洗脱方式对5种抗生素分离的影响,结果表明:采用在线梯度洗脱更为合理,因此后续实验中采取梯度洗脱模式进行分离。

β2内酰胺类抗生素的紫外最大吸收在210nm,采用梯度洗脱模式时该波长处检测会有基线漂移,但影响不大。

高波长处基线较为平稳,但吸收信号太低。

综合考虑选择210nm作为检测波长,与文献报道相近[5,6]。

经过上述条件优化,在10min之内实现了5种抗生素的分离和检测,如图1所示。

目前已有的文献报道中,同是HP LC2UV方法,Benito2Pena 等[5]分离了阿莫西林和PE NV,其中PE NV的保留时间约为14min;在后续报道[6]中,C LOX的保留时间约为18min;与国标方法(G BΠT2075522006)相比较,本方法更为快捷。

图1　5种抗生素液相色谱图
Fig.1　Chrom atograms of five tested beta2lactam antibiotics 1-氨苄西林;2-青霉素G;3-青霉素V;4-苯唑西林; 5-氯唑西林。

每种抗生素浓度为20μgΠm L
2.2　样品前处理方法
2.2.1　提取液的选择　对于猪肉样品,本实验比较了乙酸-钨酸钠的混合提取液和乙腈提取的效果。

结果发现,乙腈作提取液时,杂质较少,但回收率低;用乙酸2钨酸钠的混合提取液效果很好,回收率较高,故选用乙酸-钨酸钠的混合液作为提取液。

对于牛奶样品,比较了三氯乙酸、钨酸钠和
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乙腈的提取效果。

结果发现:无机酸或无机盐作沉淀剂时,基线漂移,色谱信号不稳定,干扰峰较多,严重干扰测定。

故本实验选用乙腈为提取液。

2.2.2　提取液浓度的选择　比较了0.1%乙酸2 25gΠL Na2W O4的混合液和0.5%乙酸250gΠL Na2W O4的混合液对猪肉样品中5种抗生素的提取效果,实验结果表明:采用0.5%乙酸250gΠL Na2W O4的混合液提取效果好,回收率较高。

2.3　固相萃取过程的选择
分别采用Waters Oasis H LB固相萃取柱(填充亲水亲脂平衡的反相吸附剂)、Agilent Bond ODS C18柱对5种抗生素水溶液进行萃取,比较二者对5种抗生素的富集效果。

结果表明:C18萃取柱的平均回收率高于50%,而H LB柱回收率高于70%,故实验中选用H LB萃取柱。

猪肉和牛奶中含有大量的有机物质,萃取过程中会被吸附在萃取柱上,并与目标化合物一起被洗脱。

用HP LC定量测定时,由于杂质的存在使得基线大幅度漂移,严重干扰目标化合物的判识和定量检测。

因此,在洗脱前可用含一定比例有机溶剂的超纯水淋洗萃取柱,以减小基质的干扰。

结果表明:用约5m L含5%甲醇的超纯水淋洗能达到较好的净化效果。

实验中分别选用体积分数为30%～100%的甲醇洗脱。

甲醇浓度在90%以上时洗脱较完全,回收率较高,故选择100%的甲醇作为洗脱液。

进一步考察了洗脱剂流速在1～4m LΠmin范围内对萃取率的影响,结果表明:洗脱液流速在2m LΠmin 以下时,回收率高且重复性好。

2.4　方法学考察
2.4.1　校正曲线及检出限　配制混合标准品系列浓度分别为015、1、5、15、20、30、40μgΠm L的工作液。

在最佳条件下测定,以峰面积(y)为纵坐标,浓度(ρ)为横坐标作校正曲线。

回归方程及相关系数见表1。

表1　标准曲线分析结果
T ab.1　R esults of regression analysis of calibration curves 组分
线性范围
ρΠ(μgΠm L)
回归方程
相关系数
R2 AMPI0.5～40y=36.931ρ-13.0080.9995 PE NG0.5～40y=46.925ρ-8.47670.9996 PE NV0.5～40y=43.242ρ-1.30790.9998 OX AC0.5～40y=67.898ρ-9.39430.9997
C LOX0.5～40y=81.004ρ-10.5110.9999
2.4.2　精密度　配制5μgΠm L和0.5μgΠm L混合标准品溶液,连续进样6次,考察精密度。

保留时间和峰面积的相对标准偏差(RS Ds)见表2。

表2　分析组分的保留时间和峰面积的精密度
T ab.2　V ariability of retention time and peak areas of tested antibiotics(n=6)
组分
5μgΠm L
保留时间tΠmin
平均值RS DΠ%
峰面积
平均值RS DΠ%
0.5μgΠm L
保留时间tΠmin
平均值RS DΠ%
峰面积
平均值RS DΠ%
AMPI 6.210.411710.92 6.100.1619.7 1.0 PE NG7.710.392350.297.570.1724.30.99 PE NV8.500.342080.938.370.1720.5 3.0 OX AC9.080.323530.238.940.1834.8 1.4 C LOX9.840.333880.819.700.1839.7 1.0
2.4.3　样品回收率和重现性
猪肉样品中加入1、015、012mgΠkg3种不同浓度的抗生素混合标准溶液,按照前述方法处理样品,每个添加水平平行做5次,分别计算加标样品的平均回收率(n=5)及精密度,所得结果见表3。

在加标样品谱图中,按照信噪比为3时抗生素对应浓度来计算方法检出限,方法对猪肉样品中5种抗生素的检出限为113μgΠkg(AMPI);
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019μgΠkg(PE NG);112μgΠkg(PE NV);017μgΠkg (OX AC)和016μgΠkg(C LOX),低于国标方法检测限(农业部958号公告2722007),也低于欧盟(2377Π90ΠEC)规定的食品中对应抗生素最大残留量(MR Ls)[1]。

表3　猪肉加标样品的回收率
T ab.3　R ecoveries of antibiotics from spiked swine meat samples(n=5)
组分
加标水平
1mgΠkg
平均回收率Π%RS DΠ%
0.5mgΠkg
平均回收率Π%RS DΠ%
0.2mgΠkg
平均回收率Π%RS DΠ%
AMPI90.2 5.091.4 6.080.8 6.0 PE NG83.88.372.3 6.974.9 4.9 PE NV66.47.746.49.362.0 6.8 OX AC79.0 4.964.2 6.381.9 5.6 C LOX73.2 5.368.7 3.680.2 3.5
牛奶样品中加入1、4、8μgΠm L3种不同浓度的抗生素混合标准溶液,按照前述方法处理样品,每个添加水平平行做5次,分别计算加标样品的平均回收率(n=5)及精密度,数据见表4。

采取与猪肉样品相同的方法计算方法对牛奶样品的检出限,结果表明牛奶中基体干扰略大,5种抗生素的检出限高于猪肉中对应组分的检出限,分别是219μgΠL(AMPI);312μgΠL(PE NG);316μgΠL (PE NV);312μgΠL(OX AC)和314μgΠL(C LOX),检出限均低于欧盟(E U)规定的牛奶中各抗生素最大残留量(MR Ls)[1]。

表4　牛奶加标样品的回收率
T ab.4　R ecoveries of antibiotics from fortified milk samples(n=5)
组分
加标水平
1μgΠm L
平均回收率Π%RS DΠ%
4μgΠm L
平均回收率Π%RS DΠ%
8μgΠm L
平均回收率Π%RS DΠ%
AMPI92.5 2.694.8 1.693.0 3.2 PE NG81.9 5.962.37.770.6 6.8 PE NV72.8 3.164.5 6.571.4 4.2 OX AC71.3 4.871.5 4.274.97.6 C LOX73.4 5.267.27.162.19.0
2.4.4　样品测定　取市场上采集的猪肉样品按方法进行SPE处理和HP LC检测,未检测出5种抗生素,且猪肉中其他成分对测定无干扰。

对市场上出售的牛奶样品加以检测,未检出5种抗生素,但基体其他组分对牛奶中部分抗生素(AMPI及PE NG)的检测略有干扰。

经计算,干扰组分与待测物质色谱峰分离度在1.1～1.4之间,基本可以实现抗生素含量测定。

参考文献
[1]　K antiani L,Farre M and Barcelo D.T rends Anal Chem,
2009,28:729
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[3]　张　琦,叶能胜,谷学新等.化学通报,2009,72(5):
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Anal Chim Acta,2006,556:415
[6]　Benito2Pena E,Urraca JL,M oreno2Bondi MC.J Pharm
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Chem,2001,371:64
Development of SPE2HP LC method for simultaneous determination of five beta2lactam antibiotic residues in milk and swine meat samples
YE Neng2sheng,G U Xue2xin3and ZH ANG Qi(Department of Chemistry,Capital N ormal University,Beijing 100048),Fenxi Shiyanshi,2010,29(6):73～77
Abstract:A rapid high performance liquid chromatographic(HP LC)method with UV detection was developed for si2 multaneous determination of five beta2lactam antibiotics:am picilin;penicillin G;penicillin V;cloxacillin and oxacil2 lin in milk and swine meat.A chromatographic separation was achieved in10min on a C18column with the m obile phase consisting of acetonitrile and0.1%amm onia mixture in a gradient m ode.Detection was carried out at210nm. Validation experiments were performed to dem onstrate linear ranges;precision,recovery and limit of detection(LOD). The principal advantages of this method are sim plicity,quickness,and no derivatization being needed.
K eyw ords:Beta2lactam antibiotic;High performance liquid chromatography;S olid phase extraction;Milk;S wine meat
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