β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ的工艺

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2 方法与结果
主要以淫羊藿苷为原料,选择酶解能力较强的纤维素酶、 柚皮苷酶与β-葡萄糖苷酶为水解酶,从中筛选出最佳酶系。 2.1 淫羊藿苷酶解工艺
精密称取 0.5 g 淫羊藿苷,置于 50 mL 容量瓶中,纯净水定 容,得 10 mg·mL-1的淫羊藿苷混悬液。分别称取 0.4 g 纤维素 酶、β-葡萄糖苷酶、柚皮苷酶置于 10 mL 容量瓶中,纯净水定 容,得浓度均为 40 mg·mL-1 的各酶液。精密吸取适量的淫羊 藿苷混悬液与 1 种酶液置于密闭容器中,反应液的 pH 值在酶 水解活性范围内,酶活性适宜温度条件下,转速为 50 r·min-1,振 摇反应完全后加入乙醇,过滤后除去乙醇,得宝藿苷Ⅰ粗品。 2.2 分析方法 2.2.1 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Phenomenex Luna C18(250 mm ×
245反应时间对宝藿苷转化率的影响按质量比1取葡萄糖苷酶和淫羊藿苷加入ph值为50的枸橼酸枸橼酸三钠缓冲液中配制成淫羊藿苷含量为1mgml1液在温度为50条件下酶解于305060708090min取样计算宝藿苷转化率每个时间点各平行做3可以看出在50min以内宝藿苷的转化率达8526随着反应时间延长宝藿苷转化率也增加到90min时宝藿苷的转化率基本达到100
宝 藿 苷 Ⅰ 为 小 檗 科 淫 羊 藿 属 植 物 淫 羊 藿 Epimedium brevicornum Maxim.中的一种多羟基黄酮类单体成分,有较好 的抗肺癌细胞活性,明显优于淫羊藿中其他黄酮苷类化合物, 亦有文献报道其生物药剂学性质明显优于淫羊藿中其他黄酮 类多糖苷[1]。药理研究表明,宝藿苷Ⅰ具有抗肿瘤、抗骨质疏 松等作用[2~4]。有报道大鼠口服淫羊藿苷后在粪便和尿液中均 检出宝藿苷Ⅰ,推测大鼠肠菌酶可将淫羊藿苷转化为宝藿苷 Ⅰ,吸收入血的主要为宝藿苷Ⅰ[5]。宝藿苷Ⅰ在淫羊藿药材中 的含量较低,由于极性相当的成分很多,故分离纯化较困难。 酶解反应具有选择性高、反应条件温和、转化率高、分离纯化 容易、对环境无污染及成本低廉等优点[6,7]。β-葡萄糖水解淫羊 藿苷主要是 C-7 位去葡萄糖,能够选择性地切断淫羊藿 C-7 位 的β-D-葡萄糖,效果优于纤维素酶。本试验研究了β-葡萄糖苷 酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ的工艺,旨在为宝藿苷Ⅰ的工 业化生产提供参考。
果,宝藿苷Ⅰ峰面积的 RSD=1.12%(n=7),表明供试品溶液
在 24 h 内稳定。
2.2.7 重复性试验 按供试品溶液的制备项下操作,平行制
备 6 份样品,照上述色谱条件测定。结果,宝藿苷Ⅰ峰面积的
RSD=1.56%(n=6),表明方法重复性良好。
2.2.8 加样回收率试验 精密量取已知宝藿苷Ⅰ浓度(浓度:
Preparation Technology of Baohuoside Ⅰ by Enzymolysis of Icariin with β-glucosidase ZHANG Zhen-hai,CHEN Ling-ling,JIA Xiao-bin,HE Jun-jie,JIN Xin(Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Materia Medica,SACTM,Jiangsu Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210028,China)
混悬液 200 μL、β-葡萄糖苷酶液 50 μL、1.75 mL pH 值为 5.0 的
枸橼酸-枸橼酸三钠缓冲液,置于 10 mL 具塞试管中,分别于
30、37、50、60、70 ℃反应 50 min 后,加入 8 mL 乙醇终止反应,
计算宝藿苷Ⅰ转化率(每个温度各平行做 3 份),结果见图 3。
side Ⅰ;2. icariin
2.2.2 标准品溶液的制备 精密称取 105 ℃干燥至恒重的宝
藿苷Ⅰ标准品 2.85 mg,置 10 mL 容量瓶中,加乙醇适量,超声
溶解,放冷,加乙醇定容,摇匀,得质量浓度为 0.285 mg·mL-1的
标准品溶液,冰箱中贮藏,备用。
2.2.3 供试品溶液的制备 吸取淫羊藿苷混悬液和 1 种酶液
of baohuosideⅠ(n=3)
由图 2 可以看出,在 3 种供试酶中,β-葡萄糖苷酶能在 12 h
内将淫羊藿苷转化为宝藿苷Ⅰ,且转化率最高,达到 10-葡萄糖苷酶作为最佳酶系。
2.4 β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷工艺研究
2.4.1 酶解反应最适温度 精密吸取 10 mg·mL-1的淫羊藿苷
别精密吸取各标准溶液及“2.2.2”项下溶液 10 μL,注入液相色
谱仪,记录峰面积。以宝藿苷Ⅰ检测浓度(X,μg·mL-1)为横坐
标,峰面积积分值(Y)为纵坐标,进行线性回归,得回归方程为
Y=192 784X+1 840 729(r=0.999 8,n=5)。结果表明,宝藿苷
Ⅰ检测浓度在 8.90~285.00 μg·mL-1范围内与峰面积积分值呈
苷的保留时间分别为 9.088、2.474 min。色谱见图 1。
1
2
1
2 4 6 8 10 min
2 4 6 8 10 min
A
B
图 1 高效液相色谱图
A. 宝藿苷Ⅰ标准品;B. 酶解样品;1.宝藿苷Ⅰ;2.淫羊藿苷
Fig 1 HPLC chromatograms
A.baohuoside Ⅰ standard substance;B. enzymolysis sample;1. baohuo-
·中药工艺与制剂·
β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ的工艺研究Δ
张振海*,陈玲玲,贾晓斌#,贺俊杰,金 鑫(江苏省中医药研究院国家中医药管理局中药释药系统重点研究室, 南京市 210028)
中图分类号 R284;R283
文献标识码 A
文章编号 1001-0408(2011)43-4059-03
摘 要 目的:研究用β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ的工艺。方法:采用β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ, 以转化率为指标,通过单因素试验考察温度、pH 值、酶与底物质量比、底物浓度和反应时间对转化率的影响。结果:酶解反应的优 化条件为温度 50 ℃、pH=5.0 的枸橼酸-枸橼酸三钠缓冲液、酶与底物质量比 1 ∶ 2、底物浓度 1 mg·mL-1、反应时间 90 min。结论: β-葡萄糖苷酶酶解淫羊藿苷制备宝藿苷Ⅰ,转化率高,工艺简单、可靠,反应条件温和。 关键词 淫羊藿苷;宝藿苷Ⅰ;β -葡萄糖苷酶;生物转化
良好的线性关系。
2.2.5 精密度试验 精密吸取 71.25 μg·mL-1的宝藿苷Ⅰ标准
品溶液 10 μL,按上述色谱条件连续进样 6 次,测定峰面积。结
果,宝藿苷Ⅰ峰面积的 RSD=0.11%(n=6),表明仪器精密度
良好。
2.2.6 稳定性试验 取同一份配好的供试品溶液,室温放置,
分别于 0、1、2、4、8、12、24 h 进样,按上述色谱条件测定。结
ABSTRACT OBJECTIVE:To study the preparation technology of baohuoside Ⅰ by enzymolysis of icariin with β-glucosidase. METHODS:Taking bioconversion rate as index,β-glucosidase was used for enzymolysis of icariin and the effects of temperature, pH value,the ratio of enzyme to substrate,substrate concentration and reaction time on conversion rate of baohuoside Ⅰ were investigated by single factor test. RESULTS:The optimum reaction conditions were determined as follows:50 ℃,citric acid-citric acid sodium acetate buffer(pH 5.0),the ratio of enzyme to substrate 1 ∶ 2,substrate concentration 1 mg·mL-1 and reaction time 90 min. CONCLUSION:It is simple and reliable to prepare baohuoside Ⅰ by the enzymolysis of icariin with β-glucosidase;the conversion rate is high and the technology is moderate. KEY WORDS Icariin;Baohuoside Ⅰ;β-glucosidase;Bioconversion
中国药房 2011 年第 22 卷第 43 期
China Pharmacy 2011 Vol. 22 No. 43 · 4059 ·
4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(75 ∶ 25);检测波长:270 nm;
流量:1.0 mL·min-1;柱温:30 ℃;进样量:20 μL。在此色谱条
件下分别进样标准品和供试品溶液,结果宝藿苷Ⅰ和淫羊藿
1 仪器与试药
高效液相色谱(HPLC)仪,包括 600 型泵、717 自动进样 器 、2996DAD 紫 外 检 测 器 、Empower 数 据 处 理 系 统(美 国
Δ 国家自然科学基金资助项目(30973944) * 助 理 研 究 员 ,博 士 。 研 究 方 向 :天 然 药 物 。 电 话 :02585608672。E-mail:davidpharm@ # 通讯作者:研究员,博士研究生导师。研究方向:天然药物。电 话:025-85608672。E-mail:jxiaobin2005@
Waters 公司);数显气浴恒温振荡器(金坛市双捷实验仪器厂); AL204 十万分之一天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司); 离心机(上海安亭科学仪器厂)。
淫 羊 藿 苷(陕 西 慧 科 植 物 开 发 有 限 公 司 ,批 号 : ES20060310,纯度>98%);纤维素酶、β-葡萄糖苷酶(夏盛实 业集团有限公司);柚皮苷酶(济宁和美生物工程有限公司); 0.45 μm 微孔滤膜(江苏汉邦科技有限公司);宝藿苷Ⅰ标准品 (笔者自制,纯度>98%);甲醇、乙腈为色谱纯,水为高纯水, 其余试剂均为分析纯。
0.3 mg·mL-1)的供试品溶液 6 份,每份 0.5 mL,分别精密加入标
准品溶液 0.5 mL,混匀后,照上述色谱条件测定,计算加样回
收率。结果,平均回收率为 96.54%,RSD=1.47%(n=6)。
2.2.9 宝藿苷Ⅰ 转化率的测定 宝藿苷Ⅰ转化率=cV(/ m×
M1/M2)×100%。式中,c 为酶解后混悬液中宝藿苷Ⅰ的质量浓
置于 10 mL 具塞试管中,加入一定的缓冲液,置于一定的温度
下,反应一定时间,加入乙醇终止反应,并定容至 10 mL,摇匀,
0.45 μm 微孔滤膜过滤后即得供试品溶液。
2.2.4 线性关系考察 精密量取宝藿苷Ⅰ标准品溶液适量,
分别置于 10 mL 量瓶中,用甲醇稀释并定容,得浓度分别为
142.50、71.25、35.62、17.81、8.90 μg·mL-1的标准系列溶液。分
度;V 为混悬液体积;m 为酶解前淫羊藿苷的量(mg);M1 为宝
藿苷Ⅰ的相对分子质量;M2为淫羊藿苷的相对分子质量。
2.3 酶系筛选
精密吸取 10 mg·mL-1 的淫羊藿苷混悬液 200 μL,分别加
入 50 μL β-葡萄糖苷酶液、纤维素酶液、柚皮苷酶液,再加入
1.75 mL pH 值为 5.0 的枸橼酸-枸橼酸三钠缓冲液,置于 10 mL
具塞试管中,置于 50 ℃气浴震荡箱中反应 12 h 后,加入 8 mL
乙醇终止反应,计算宝藿苷Ⅰ的转化率(每种酶系各平行做 3
份),结果见图 2。
120
宝藿苷Ⅰ的转化率/%
100
80
60
40
20
0 β-葡萄糖苷酶
纤维素酶
柚皮苷酶
图 2 各种酶对宝霍苷Ⅰ的转化率(n=3)
Fig 2 Effect of different enzyme on the biotransformation
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