胞外聚合物对莱茵衣藻砷富集和形态转化的影响

湖南农业大学学报(自然科学版) 2019, 45(4):384–390. DOI:10.13331/ki.jhau.2019.04.009 Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) 投稿网址：
胞外聚合物对莱茵衣藻砷富集和形态转化的影响
李崇华1，赵方慈1，喻琪盛1，陈杨沁1，张春华2，葛滢1*
(1.南京农业大学资源与环境科学学院，江苏 南京 210095；2.南京农业大学生命科学实验中心，江苏 南京 210095)
摘 要：为探明胞外聚合物(EPS)对微藻砷的富集和迁移的作用效果，采用1 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)对莱
茵衣藻EPS 进行提取，测定EPS 含量及其主要成分，运用LIVE/DEAD BacLight staining–LSCM 观察去除和未去除EPS 的莱茵衣藻的生长情况，并对藻细胞进行AsV 处理(20 μg/L 、处理6.0 h)，比较有(无)EPS 的莱茵衣藻对砷的吸收、吸附和转化的差异。

结果表明：莱茵衣藻EPS 总量为16.12 mg/g ，其主要成分为多糖(89.96%)，并含有少量的蛋白质(7.41%)和DNA(2.63%)，EDTA 提取EPS 后没有细胞自溶现象产生，不影响微藻的生长；去除EPS 后的莱茵衣藻对AsV 的还原能力显著降低，且在6.0 h 内对砷的吸收没有明显变化，但砷吸附量占富集的比例(43.03% ~ 66.23%)显著高于有EPS 的砷吸附占比(10.68% ~ 31.90%)，表明EPS 在莱茵衣藻对砷的富集和形态转化中具有重要作用。

关 键 词：莱茵衣藻；胞外聚合物；砷；富集；转化
中图分类号：X52 文献标志码：A 文章编号：1007−1032(2019)04−0384−07
Effects of extracellular polymeric substances on the accumulation and
transformation of arsenic by Chlamydomonas reinhardtii
LI Chonghua 1, ZHAO Fangci 1, YU Qisheng 1, CHEN Yangqin 1, ZHANG Chunhua 2, GE Ying 1*
(1.College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu 210095, China;
boratory Centre of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu 210095, China)
Abstract : In order to explore the effects of extracellular polymeric substances (EPS) on the accumulation and migration of arsenic(As) in microalgae, EPS of Chlamydomonas reinhardtii were extracted with 1 mmol/L ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA). The content and major components were determined and the cell viabilities after EPS removal were observed using LIVE/DEAD BacLight staining and laser confocal microscopy. The As absorption, adsorption and transformation by C. reinhardtii with and without EPS were compared under the AsV treatment(20 μg/L, 6.0 h). The results showed that the total EPS of C. reinhardtii was 16.12 mg/g, with primary component of polysaccharide(89.96%) and a small amount of protein (7.41%) and DNA (2.63%). The EDTA extraction did not cause cell lysis and did not affect the growth of C. reinhardtii . The AsV reduction by C. reinhardtii was significantly reduced after the removal of EPS. No significant change in the As absorption was found within 6.0 h, however, the ratio of As adsorption to accumulation of C. reinhardtii without EPS (43.03%-66.23%) was significantly higher than that with EPS(10.68%-31.90%), indicating that EPS may play an important role in the accumulation and transformation of arsenic by C. reinhardtii .
Keywords : Chlamydomonas reinhardtii ; extracellular polymeric substances; arsenic; accumulation; transformation
收稿日期：2019–03–13 修回日期：2019–06–27
基金项目：国家自然科学基金项目(31770548)；南京农业大学大学生创新创业训练计划项目(1813A17)
作者简介：李崇华(1993—)，男，山西运城人，博士研究生，主要从事环境生物学研究，*******************.cn ；*通信作者，葛滢，博士，
教授，主要从事环境生物学研究，******************.cn
砷(As)是一种类金属元素，广泛分布于海洋、淡水和土壤等环境中[1]。

近年来，由于地质因素和人类活动，如含砷矿产的开采和冶炼、农药以及除草剂的使用等导致砷进入水体中，对人类健康构成
第45卷第4期 李崇华等 胞外聚合物对莱茵衣藻砷富集和形态转化的影响 385
严重威胁[2–3]。

在自然水体中，砷主要以砷酸盐(AsⅤ)和亚砷酸盐(AsⅢ)形态存在[4–5]。

目前，砷污染已经成为全球性的环境问题[6]。

微藻是广泛分布于水环境中的单细胞生物，不仅可以吸附环境中的砷，而且还可以参与砷在环境中形态的转化[7–8]。

微藻在生长过程中可以向环境中分泌大量的有机高分子物质，即胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)。

EPS的主要成分有多糖、蛋白以及核酸等[9–10]。

胞外聚合物表面含有大量的功能基团，如羟基、羧基、巯基等，可以与重金属形成螯合环状物，吸附在细胞表面；或者通过改变重金属的形态，以减少对藻细胞的毒害[11–13]。

已有研究发现，EPS能增强微藻的耐砷能力，砷酸盐和亚砷酸盐可以和EPS表面的功能基团(–COOH)结合，从而阻止无机砷进入藻细胞，进而缓解砷对微藻的毒性[14]。

此外，EPS还能介导金属元素不同价态之间的转化。

研究发现EPS中具有还原性多糖，可以将Au3+和Ag+等高氧化态的金属离子发生还原反应，在细胞表面生成纳米颗粒[15–16]。

王淑等[5]研究发现，螺旋藻可以将培养液中的AsIII 快速氧化成AsV并吸附于细胞表面，进一步证实了EPS在金属元素的形态转化中具有重要的作用。

水体中，砷主要以含氧阴离子的形式存在，其与EPS 的相互作用与阳离子重金属有明显的差异。

目前关于微藻EPS与砷的相互作用的研究主要集中在EPS 对砷的吸附，而EPS在介导砷的富集和形态转化中的作用尚不清楚。

莱茵衣藻是一种广泛存在于淡水环境中的模式藻类，具有生长快、周期短、易培养等优点。

目前的研究发现，莱茵衣藻可以分泌较多的EPS，最多可达70.42 mg/g(以干质量计) [17]，而且对AsV和AsIII有一定的耐性，其EC50值分别为(2 358.3± 27.8)、(21 183.6±406.4) μg /L，并在低磷条件下富集As最大值可达428.6 mg/kg，具有较强的砷富集、吸收能力[18]；因此，本实验中，以莱茵衣藻为研究对象，采用EDTA法提取EPS，在一定浓度的砷酸盐处理下，通过测定去除和未去除EPS的莱茵衣藻对砷的吸附、吸收量和各形态的含量，比较有(无)EPS的莱茵衣藻对AsV富集和转化的影响，以期为水体砷污染治理提供理论依据。

1材料与方法
1.1材料
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)购自中国科学院水生生物研究所(武汉)。

采用Tris – acetate – phosphate(TAP)培养基进行培养，藻种传代扩增及培养过程中均保证无菌操作。

1.2试验设计
1.2.1 莱茵衣藻EPS的提取及去除EPS后莱茵衣
藻的生长情况
将生长至对数期的无菌莱茵衣藻接种至200 mL新鲜的TAP培养基中，初始细胞浓度OD680约为0.06(细胞数约为105个/mL)，培养至生长稳定前期(96 h)，将200 mL藻液5 000g离心5 min后，收集藻细胞，用20 mL质量分数为0.85% NaCl溶液冲洗2～3次后，加入等体积的EDTA溶液(1 mmol/L)，对EPS进行提取，恒温振荡 3 h，于 11 000g离心15 min，收集上清液，经0.22 μm 滤膜过滤，得到含 EPS 的待测液。

藻细胞使用新鲜的TAP培养基重新悬浮，以离心法(8 000g、5 min)收集的藻液作为空白对照，分别于0、3.0、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0 h对微藻的生长情况进行测定，并对EDTA法提取前后的微藻进行细胞活性检测。

1.2.2 有(无)EPS的莱茵衣藻对AsV的富集和形态
转化的影响
将培养至生长稳定期(96 h)的莱茵衣藻，采用EDTA法对EPS进行提取[17]，离心(11 000g、15 min)去除含有EPS的上清液，收集藻细胞。

将有(无)EPS 的藻细胞使用新鲜的TAP培养基重新悬浮于100 mL的锥形瓶中，使藻液OD680为0.08。

AsV处理质量浓度为20 μg/L，分别在0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h测定微藻的生长情况，并离心(8 000g、5 min)收集上清液和藻细胞，其中上清液用于测定培养液各形态砷的含量和砷总量；藻细胞样品分为两部分，一部分藻细胞使用去离子水清洗3遍，用于测定莱茵衣藻对砷的富集量，另一部分藻细胞使用预冷的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.0)清洗3遍，以去除吸附在细胞表面的砷[7,19–20]，用于测定
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莱茵衣藻对砷的吸收量和胞内的各形态砷的含量。

所有样品均置于超低温冰箱(–60 ℃)冷冻待测。

1.3测定项目及方法
1.3.1 生物量测定
将莱茵衣藻接入新鲜的TAP培养基，初始藻细胞浓度OD680值0.06(即细胞数为105个/ mL)，分别于6、12、24、36、48、72、96 h，利用酶标仪(Molescular Devices，美国)在680 nm处测定其OD 值，并离心(8 000g、15 min)收集5 mL的莱茵衣藻，使用冷冻干燥机(FD–1A–50，上海比朗仪器制造有限公司)冷冻干燥24 h，采用差量法计算莱茵衣藻的干质量。

以莱茵衣藻藻液的吸光度OD680值为横坐标，以细胞干质量为纵坐标作图。

线性回归分析后得到回归方程为：y = 0.003 5x – 0.000 1，决定系数R2 = 0.981 9。

1.3.2 微藻细胞活性检测
将EDTA法提取后的微藻细胞与无菌TAP培养液重新悬浮，以离心法(8 000g、5 min)作为空白对照，取 1 mL微藻悬浮液与等体积的LIVE/DIED BacLight 染色剂振荡混匀，暗反应15 min，取10 μL 的微藻悬浮液于载玻片上，使用Ism800激光共聚焦显微镜进行细胞活性观测。

1.3.3 EPS主要成分测定
莱茵衣藻EPS的主要成分有多糖、蛋白和核酸。

多糖含量的测定以葡萄糖为标准物质，采用苯酚–硫酸法[21]，向试管中加入1 mL待测样品，加入显色液(5%苯酚溶液与98%浓硫酸按体积比1∶5混合)3 mL，混匀并放置于沸水中加热25 min，冷却至室温后用分光光度计在490 nm处进行测定；蛋白质含量的测定以牛血清白蛋白为标准物质，采用Bradford比色法[22]，向试管中加入1 mL待测样品，加入考马斯亮蓝液(称取0.1 g考马斯亮蓝G–250，溶于50 mL 95%乙醇，加入100 mL质量浓度为0.85 g/mL的磷酸，定容至1 000 mL)5 mL，振荡混匀，显色5 min后用分光光度计在595 nm处进行测定；DNA的测定以小牛胸腺DNA为标准物质，采用二苯胺法[23]，向试管中加入待测样品2 mL，二苯胺试剂(称取1 g二苯胺，溶于100 mL 冰乙酸中，加入60%以上的过氯酸10 mL，混匀待用，临用前加入1 mL 的1.6%乙醛)4 mL，混匀后于60 ℃水浴加热1 h，冷却至室温后用分光光度计在595 nm处进行测定。

所有样品均测定3次，结果取其平均值。

1.3.4 莱茵衣藻总As的测定
准确称取0.5 g冷冻干燥后的藻样于50 mL的玻璃消煮管中，加入2.5 mL的混酸(硝酸与高氯酸的体积比为4∶1)溶液，摇匀浸没过夜。

使用石墨电热消煮仪(海能SH230石墨消解仪，上海海能实验仪器科技有限公司)(121±3) ℃加盖消解至溶液呈无色透明状，然后开盖赶酸剩至0.2 mL左右，静置冷却至室温，将溶液转移至10 mL的容量瓶中，加入0.5 mL的HCl和1 mL的还原剂(10%硫脲和10%抗坏血酸)定容，样品与还原剂、盐酸的反应时间约为1.5 h。

样品中总As含量用氢化物发生–原子荧光光谱仪(HG–AFS，AFS–8230，北京吉天仪器有限公司)进行测定[24]。

1.3.5 莱茵衣藻样品中各形态砷的含量测定
莱茵衣藻样品中各形态砷使用稀硝酸进行提取：准确称取0.5 g样品于10 mL离心管中，加入2 mL 1.75% HNO3(0.28 mol/L)，置于90 ℃的超声波清洗机(frequency，40 kHz，南京先欧仪器制造有限公司)中超声10 min后，在14 000g下离心10 min，重复提取3次并将提取液合并，使用0.22 μm的滤器过滤[24–25]。

样品使用高效液相色谱(HPLC–HG– AFS，HPLC为Shimadzu LC–15C，Shimadzu)–原子荧光光谱仪(HG–AFS为AFS–8230，北京吉天仪器有限公司)进行胞内和培养液中各形态As的含量测定。

1.4质量控制
采用消解标准物质米粉(NIST–SRM 1568b)来对本实验测定结果的可靠性进行评估。

米粉的消解与样品的消解同时进行，设置3个平行实验。

测得的标准物质米粉中的总As的回收率为85.2% ~ 104.3%；测得标准物质中米粉的无机砷和DMA含量分别为(0.093±0.07) mg/kg和(0.184±0.02) mg/kg，与标准物质中的含量接近，说明本实验消解完全，测定数据可靠。

1.5数据处理
实验数据采用Excel(Office 2016)和SPSS 19软件进行处理和统计分析；处理间显著性差异分析采用Tukey；运用Duncan多重比较法进行单因素方法
第45卷第4期 李崇华等 胞外聚合物对莱茵衣藻砷富集和形态转化的影响 387 分析；采用SigmaPlot 12.5绘制图表。

2结果与分析
2.1莱茵衣藻EPS的表征及去除EPS后藻细胞的
活性
由图1可知，EDTA法提取到的莱茵衣藻EPS
含量为(16.12±0.81) mg/g。

其中多糖占EPS含量的
89.96%，蛋白质和DNA占比分别为7.41%和2.63%。

通常使用DNA含量来表征提取方法对微藻细胞的
破坏程度。

当使用1 mmol/L的EDTA提取时，DNA
的含量(0.42 ± 0.05) mg/g和占EPS含量比例(2.63%)
均较低，结合LIVE/DEAD BacLight staining–LSCM
观察发现(图2)，运用EDTA对莱茵衣藻EPS提取
后，图2–b中绿色荧光明显多于红色，与离心法相
似，说明EDTA法对莱茵衣藻细胞的破坏较小，没
图1莱茵衣藻胞外聚合物的主要组成及含量
Fig. 1Composition and content of the C. reinhardtii EPS
a离心法(CK)；b EDTA法。

图2莱茵衣藻去除EPS后的LIVE/DEAD BacLight staining–LSCM观察结果
Fig. 2LIVE/DEAD BacLight staining – LSCM images of C. reinhardtii after the EPS removal
2.2EDTA提取法对莱茵衣藻的生长影响
通过对不同时间点的微藻藻液进行OD680测定
图3离心法和EDTA法提取EPS后莱茵衣藻的生长
(OD680)情况
Fig.3Growth (OD680) of C. reinhardtii with EPS removed by
centrifugation and EDTA
和EDTA法去除EPS后微藻的OD680值均逐渐增
加，并在96.0 h时莱茵衣藻的OD680值分别达到了
2.144±0.062、2.040±0.044，说明使用EDTA法对去
除EPS后的莱茵衣藻的生长没有显著影响(P＞
0.05)。

2.3砷酸盐处理下有(无)EPS对培养液中砷形态
的影响
20 μg/L AsV处理6.0 h，有(无)EPS莱茵衣藻的
培养液中As形态的动态变化过程如图4所示。

在
EPS存在的情况下，随着AsV暴露时间的增加，培
养液中AsV的含量显著降低(P＜0.05)，在处理1.0 h
时，有AsⅢ的出现并逐渐增加，最终以AsIII为主
要形态存在，这与微藻胞内AsV和AsⅢ的变化趋
势一致，说明在6.0 h内，莱茵衣藻快速吸收AsV，
并大量外排AsⅢ。

在4.0 h时培养液中有DMA出
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现，可能是微藻在胞内将部分As Ⅲ转化为DMA ，并外排至培养基；而当去除EPS 后，随着AsV 暴
在，在处理至1.0 h 时有DMA 出现，并一直存在于培养液中，且其含量无明显变化。

结果表明，去除
图4 20 μg/L AsV 处理6.0 h 内莱茵衣藻培养液中砷的形态和含量
Fig.4 As speciation and content in the C. reinhardtii growth medium after 20 μg/L AsV exposure for 6.0 h
2.4 砷酸盐处理下有(无)EPS 的莱茵衣藻对砷酸
盐富集的影响
由表1可知，当EPS 存在的情况下，莱茵衣藻砷的富集、吸收和吸附量随着AsV 暴露时间的增加呈现先增加后减少的趋势，在4.0 h 时对砷的富集量达到最大值(90.83±0.49、76.56±0.77、14.27±0.52)，这与培养液中As 含量变化一致(图4)；而当去除EPS 后，不同时间点莱茵衣藻对砷的吸收没有出现
显著变化，富集和吸附的砷含量均在4.0 h 时达到最大值。

在不同时间点，有EPS 的莱茵衣藻对砷的吸附占富集量的比例(10.68% ~ 31.90%)明显低于去EPS 后的莱茵衣藻(43.03% ~ 66.23%)。

实验结果表明，去除EPS 后，莱茵衣藻对AsV 的吸附更加显著，进而说明其在莱茵衣藻对AsV 的富集过程中起着重要的作用。

表1 AsV 处理时有(无)EPS 的莱茵衣藻富集、吸收和吸附的砷含量及比例
Table 1 The amounts and proportion of accumulated, absorbed and adsorbed As by C. reinhardtii with and without EPS treated with AsV
砷富集含量/(mg·kg –1) 砷吸收含量/(mg·kg –1) 砷吸收比例/% 砷吸附含量/(mg·kg –1) 砷吸附比例/%处理 时间/h
有EPS
无EPS
有EPS
无EPS
有EPS
无EPS
有EPS
无EPS
有EPS 无EPS
0.5 (22.23±0.42)e (47.58±1.37)b (15.86±0.39)e 16.07±2.55 71.35 33.77(6.37±0.46)c (31.51±1.18)a 28.6566.231.0 (26.59±0.66)d (37.05±0.00)c (18.11±0.37)d 21.22±0.00 68.10 57.27
(8.48±0.64)b (15.82±0.00)c 31.9042.702.0 (45.70±0.46)c (45.37±1.16)b (37.00±1.49)c 20.80±1.16 80.96 45.85(9.70±1.15)b (24.40±2.56)b 21.2353.784.0 (90.83±0.49)a (59.86±0.98)a (76.56±0.77)a 20.66±0.00
84.29 34.51
(14.27±0.52)a (38.22±0.00)a 15.7163.856.0 (51.46±0.65)b (33.38±1.16)d (45.97±0.57)b 19.71±0.34 89.32 59.05(5.50±0.63)c (14.36±0.40)c 10.68
43.02
同列不同字母表示莱茵衣藻砷的富集、吸附和吸收在不同时间点之间的差异显著(P < 0.05)。

3 讨论
高效提取是研究微藻EPS 与重金属相互作用的前提。

本实验中，采用EDTA 法对莱茵衣藻胞外聚合物进行提取，提取到的EPS 含量为16.12 mg/g ，EPS 的主要成分为多糖、蛋白和DNA ，提取过程中没有出现细胞自溶现象。

前期研究发现，使用氢氧化钠法对莱茵衣藻EPS 进行提取，EPS 最高含量可达70 mg/g [17]，
郑昊等使用加热法提取莱茵衣藻EPS 的含量也可达41.9 mg/g [26]；
因此，加热法和氢氧化 钠法可以有效地提取微藻的EPS ，但提取EPS 后对微藻生长的影响并不清楚。

本实验结果表明，使用离心法和EDTA 法提取EPS 后对莱茵衣藻的生长没有影响。

有研究[27–29]表明，温度、溶液酸碱度(pH)是影响微藻生长繁殖的重要生态因子。

温度在一定程度上会影响微藻光合作用相关酶的活性和光合作用的有关过程，进而对营养物质的吸收利用效率及细胞分裂周期等产生影响。

使用加热法提取微藻的EPS 会影响微藻的胞内酶的活性，抑制微藻的生长。

pH 不仅影响微藻的生长，而且决定培养基中3
第45卷第4期 李崇华等 胞外聚合物对莱茵衣藻砷富集和形态转化的影响 389
种碳源(CO2、HCO3–、CO32–)的相互转化，影响碳源利用效率。

使用氢氧化钠法提取EPS时，由于pH较高，影响微藻对碳源的利用效率，从而抑制微藻的生长。

对于微藻EPS提取方法的选择，应根据其选用研究材料以及后续实验的研究目的来进行选择[30]。

由于EDTA法具有EPS提取量相对较高、提取温和且不影响微藻生长等优点，故本实验选用EDTA法对微藻EPS进行提取。

一般来讲，EPS含有多种功能基团，如羧酸、氨基、磷酸等，可以通过与金属离子形成配合物将其吸附于细胞表面，从而减少对生物体的毒性。

已有研究表明，微生物产生的胞外聚合物中的C–H、C–N、C–O–C和COOH–基团以及类蛋白物质可以与AsV和AsIII结合[12,14,31]。

而本研究发现，有EPS 的莱茵衣藻对AsV的吸附明显低于去除EPS后的莱茵衣藻。

本研究结果与前人[32]报道的有所不同，ZHOU等在研究小球藻EPS对纳米银的耐性中发现，EPS可以将纳米银颗粒吸附在藻细胞表面，而去除EPS后，小球藻对纳米银的吸附量降低。

这可能有两方面的原因：1)对于带负电荷的砷酸盐离子而言，细胞壁上的吸附位点相比EPS更多；2)去除EPS后，AsV的还原减少，有利于细胞壁吸附砷。

EPS也可以通过改变微藻细胞表面性质以及对重金属形态的转化来降低金属离子在水溶液中的迁移率，进而减少对微藻的毒性。

本研究发现，在AsV 处理下，有EPS的莱茵衣藻可以在短时间内对其进行快速吸收、还原并外排，这与郑燕恒[18]的研究结果一致，而无EPS的莱茵衣藻对AsV没有还原作用。

有人发现微生物分泌的EPS具有还原重金属的能力[16]。

HUANG[33]采用EDTA法对S. putrefaciens 的EPS进行提取，并将EPS加入水合针铁矿溶液处理24 h后，AsV的还原速率显著增加。

据报道，缺失砷酸盐还原酶基因HAC、ACR2的莱茵衣藻突变体(ΔHAC–1、ΔHAC–2和ΔACR2.1、ΔACR2.2–1、ΔACR2.2–2)胞内AsV还原能力以及As的富集能力显著降低，说明砷酸盐还原酶基因在调控AsV还原过程中起重要作用[18]。

基于以上研究，笔者推测去除EPS后，莱茵衣藻对五价砷的还原能力显著降低，可能的原因有两方面：1)莱茵衣藻EPS中可能具有还原AsV的物质；
2)去除EPS可能会对莱茵衣藻胞内还原酶基因产生影响，从而减弱其还原和富集砷的能力。

然而，微藻EPS中的哪些物质影响砷的形态转化目前尚未见报道，还需进行深入研究。

4结论
1) 采用EDTA (1 mmol/L)法对莱茵衣藻EPS进行提取，EPS总量为16.12 mg/g，其中主要成分为多糖(89.96%)，并含有少量的蛋白质(7.41%)和DNA(2.63%)，没有细胞自溶现象产生，对莱茵衣藻的生长没有影响。

2) 在20 μg/L AsV处理下，去除EPS的莱茵衣藻对砷酸盐的还原能力显著降低，且对AsV的吸附率提高了32.35% ~ 34.33%，结果表明EPS在莱茵衣藻对AsV的富集、吸收过程中具有重要的作用。

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责任编辑：苏爱华
英文编辑：柳 正。