基因活化的仿生生物材料促进骨再生的实验研究

基因活化的仿生生物材料促进骨再生的实验研究
作者：罗涛刘天涛郭吕华王丽萍
来源：《医学信息》2014年第22期
摘要：目的与方法制备整合VEGF和/或BMP基因的壳聚糖/胶原支架，观察该组织工程支架的对人骨髓间充质细胞增殖、成骨向分化的影响，并比较整合不同生长因子的组织工程支架在种植体周围骨缺损模型中成骨的差异。

结果培养于整合有BMP腺病毒的支架上的骨髓间充质细胞细胞ALP活性明显高于其他组，MTT检测支架对细胞增殖无影响。

植入体内种植体周围缺损实验中，组织形态学结果显示，整合了BMP-2腺病毒的支架的骨形成量均多于未整合BMP-2腺病毒的支架，并且同时整合VEGF蛋白和BMP- 2腺病毒的支架相结合的骨生成量最高。

结论整合病毒以及生长因子蛋白的支架生物相容性好，不影响细胞在支架上的增殖。

整合VEGF蛋白和BMP- 2基因的支架在促进骨愈合中具有有协同效应。

关键词：血管内皮生长因子VEGF；BMP-2；骨再生
据估计，全世界每年有2.2 万的骨科、神经外科及口腔科患者因骨缺损行骨移植手术。

目前常见的骨移植材料有自体骨、同种异体骨、脱矿化骨基质、异种骨、合成材料、组织工程产品等。

自从灭活骨、脱钙骨能够诱导异位骨再生的现象被发现以来，科学家们认识到蛋白在诱导骨再生中起到关键作用，基于生物活性分子的骨组织工程成为研究的热点。

骨是高度血管化的组织，血管生成对骨再生至关重要。

缺乏血管生成会导致骨再生中骨形成和骨总量减少。

新生的血管对于营养供应、分子信号的传输和干细胞的运输十分重要。

血管生成对骨再生的意义重大，众多学者尝试利用促进血管生成的因子与骨再生的因子结合共同促进骨愈合。

本研究试图利用VEGF与BMP-2制备基因活化的仿生生物材料，观察其对骨缺损的愈合中的促进作用。

1 资料与方法
1.1实验分组实验分为5个组，包括：纯壳聚糖/胶原支架，记为G1（group 1）；整合BMP-2腺病毒的壳聚糖/胶原支架，记为G2（group 2）；整合VEGF腺病毒的壳聚糖/胶原支架，记为G3（group 3）；整合BMP-2腺病毒和VEGF腺病毒的壳聚糖/胶原支架，记为G4（group 4）；以及整合BMP-2腺病毒和VEGF蛋白的壳聚糖/胶原支架，记为G5（group 5）。

1.2壳聚糖胶原支架的制备及复合病毒将壳聚糖用0.5mol/L乙酸配成2%（w/v）的溶液，将胶原按2%比例溶解于壳聚糖溶液中，磁力搅拌48h后注入培养皿，4℃下放置30min，-35℃放置过夜，最后-80℃放置2h成型后移入冷冻干燥机冻干，48h后干燥完成。

支架在接种
细胞或病毒前需灭菌，具体步骤如下：先以0.3M NaOH的溶液中和材料中的乙酸，然后75%乙醇浸泡12h，大量PBS冲洗去除残余乙醇，紫外线照射30min。

将壳聚糖/胶原支架切块。

在无菌操作台内，将病毒液滴于支架上，使之浸润，具体量为：对于G2，G3组，1ml 的腺病毒溶液滴到1mg 的干燥的壳聚糖/胶原支架上，4℃过夜使支架与质粒或腺病毒充分结合，然后-80℃放置2h成型后移入冷冻干燥机干燥。

对于G4组，Ad-BMP-2与Ad-VEGF病毒液等体积混合后，吸取1ml滴到1mg壳聚糖/胶原支架上，4℃过夜使支架与质粒或腺病毒充分结合，然后-80℃放置2h成型后移入冷冻干燥机干燥。

对于G5组，将2mg VEGF-D蛋白溶解于2ml的灭菌的去离子水中，获得的终浓度为浓度为1mg/ml，将2ml溶液滴于干燥的壳聚糖/胶原支架上，再将1ml 的Ad-BMP-2病毒溶液滴到1mg 的干燥的壳聚糖/胶原支架上，所获得的支架为每1mg 支架有2mg VEGF蛋白及1mlAd-BMP-2病毒液；4℃过夜使支架与质粒或腺病毒充分结合，然后-80℃放置2h成型后移入冷冻干燥机干燥（图1示冷冻干燥机及干燥过程）。

1.3整合不同生长因子的支架对骨髓间充质细胞增殖分化影响的相关研究 MTT 法检测支架材料对骨髓间充质细胞增殖的影响。

将五种支架各选4 块置于24孔板内，第四代骨髓间充质细胞消化后，以1×105 细胞的密度接种于支架，每个支架100μl细胞悬液。

3h后添加150μl 10%FBS 的DMEM培养液继续培养，分别在1、3、7d 检测细胞增殖活性。

ALP检测：接种方法同前，3 h后添加900μl 10%FBS 的DMEM 培养液继续培养，分别在7d和14d 检测ALP活性。

具体方法如下：7和14d后，取上清液，80μl的上清加20μl的0.5M 的AMP，然后加入100μl底物，混匀后37°孵育1h。

取50μl上清，按碱性磷酸酶试剂盒说明书在405nm波长下测ALP活性。

根据换算出的每孔细胞的ALP值和DNA的总量的比值来计算每孔细胞的ALP活性，单位是nmoles paranitrophenol/ng DNA/min。

1.4骨缺损修复的观察选取 6 只2岁大的中华田园犬，手术在全麻下进行。

局部消毒后，拔除下颌前磨牙，清理牙槽窝后，去除牙槽间隔，以得到骨缺损模型。

植入种植体，将支架放入近中牙槽窝，缝合。

将G1-G5组每组中的一个样本随机置于种植体近中缺损区，以保证每只狗都含有5个组的样本。

术后肌肉注射抗生素（40万单位/ml，0.1ml/kg体重），动物软食2w。

12w时取材，截取下颌骨种植体周围缺损区骨，低速涡轮机及去离子水冲洗冷却下分割标本，进行组织学观察。

2 结果
2.1 材料制备。

2.2通过MTT法检测支架材料对骨髓间充质细胞增殖的影响。

第四代骨髓间充质细胞三维培养于支架材料中后，分别在1、3、7d检测，每组每个时间点检测四个样品。

结果显示（图2），复合病毒或/和生长因子蛋白的壳聚糖/胶原支架与壳聚糖/胶原材料对骨髓间充质细胞的增殖没有影响，病毒或/和生长因子蛋白对骨髓间充质细胞的增殖无毒性作用。

2.3 ALP活性是细胞成骨向分化的标记。

骨髓间充质细胞在各组复合支架上三维培养时的ALP活性如图3所示，7d和14d培养后，培养于复合Ad-BMP-2的支架上的骨髓间充质细胞均表现出较高的ALP活性（P
2.4组织学染色组织学切片观察种植体周围的组织形态，图4可见，种植体周围均形生成了成熟的骨组织，骨组织中均有新生成的血管。

定性观察发现，G3与G4组新生成的血管较其他组高，G2，G4及G5组的骨生成多于G1，G3组，以G5组最高。

3 讨论
骨缺损修复是复杂的生理过程，一般涉及到细胞迁移、增殖与分化以及骨重建[1]。

通常骨形成可通过两种不同的方式：假如骨断端是固定的，或者在发育阶段颅面部骨形成过程中，在将要形成骨的部位间充质前体细胞直接分化为骨细胞成骨，成为膜内成骨；若发生在有动度骨折断端间，或者发育过程中的长骨和腰椎，则先形成软骨称之为软骨化骨。

新生血管提供营养和氧气的供应，同时为血液循环中的间充质细胞提供途径到达缺损区，以及增加骨细胞的增殖分化而起作用，在骨折愈合的初期十分重要 [2]。

VEGF是主要的血管生成因子[3]。

它在出生后的血管生成起到重要的作用。

VEGF对肥厚性软骨结构和血管化都十分重要。

众多研究发现，VEGF 单独不能促进成骨[4，5]，已有研究证实VEGF与BMPs联合使用能促进细胞存活率[6]，诱导成骨细胞增殖与分化[7]，以及促进骨细胞迁移[8]，通过这种方式促进了骨的再生。

众多学者在动物模型中联合应用VEGF 与BMP-2促进骨再生，总的来说，大多数因子的联合使用较单独使用能增加成骨，单独使用VEGF 不足以促进成骨，联合使用VEGF能促进骨再生中的血管再生，这与本研究结果一致。

有研究指出，在骨折愈合中，血管发生发生在成骨之前[9]。

因此，开发一种模拟内源性基因释放的这种呈时间特异性表达的基因控释系统对骨组织工程意义十分重大。

由于VEGF在骨再生中有多种作用， VEGF除了促进成骨细胞的存活，它还能诱导血管再生。

VEGF刺激内皮的增殖与迁移，并参与祖细胞的招募及分化为内皮细胞[10，11]。

高剂量的VEGF已被证实能导致血管通透性的增加，并在骨再生中诱导产生大量的非生理性的内皮细胞管腔[12]。

研究者已经成功复合了壳聚糖/胶原支架。

对于复合支架来说，壳聚糖的加入能降低细胞介导的收缩率，即在培养细胞的过程中，复合材料的收缩度比单纯胶原支架的收缩率小，材料的机械性能有所增强。

细胞在复合支架中更容易黏附，生长并增殖。

分析是因为胶原成分的加入在四个方面提高了材料的细胞相容性：其一，降低了复合材料的孔径，增大了材料的细胞容积；其二，增大了复合材料的吸水性，使细胞在支架中更容易交换营养与代谢物；其三，胶原本身可作为细胞营养的来源；其四，降低了材料的降解性能，使细胞更容易渗透到支架内部生长继而引发进一步的支架降解。

总的来说，本实验制备了一种基因控释支架，通过冷冻干燥法使生长因子与腺病毒结合，腺病毒介导的外源性基因能高效表达，在缺损区局部释放，避免了腺病毒导致的免疫反应，在骨再生中具有潜在的应用前景。

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编辑/哈涛。