大观霉素提取工艺优化研究王维兴1

大观霉素提取工艺优化研究王维兴1
发布时间：2021-07-30T08:41:48.969Z 来源：《中国科技人才》2021年第12期作者：王维兴1 郭佳2 王文亮3 王少云4 [导读] ：本文通过对大观霉素提取工艺进行优化，得出其发酵液过滤的最适pH为3.0，最佳吸附树脂为D152，采用该树脂吸附大观霉素的过程中pH稳定，吸附效率高，收率可达84.51%。

膜过滤技术能够更好的除杂和浓缩解析液，另外浓缩液的浓度越高，析晶过程中需要的丙酮倍数越低，相同浓度下3倍体积的丙酮析晶率最高，收率达到78.75%，优化后的工艺流程精简，提取高效，降杂明显。

王维兴1 郭佳2 王文亮3 王少云4宁夏泰益欣生物科技有限公司
摘要：本文通过对大观霉素提取工艺进行优化，得出其发酵液过滤的最适pH为3.0，最佳吸附树脂为D152，采用该树脂吸附大观霉素的过程中pH稳定，吸附效率高，收率可达84.51%。

膜过滤技术能够更好的除杂和浓缩解析液，另外浓缩液的浓度越高，析晶过程中需要的丙酮倍数越低，相同浓度下3倍体积的丙酮析晶率最高，收率达到78.75%，优化后的工艺流程精简，提取高效，降杂明显。

关键词：大观霉素；提取工艺；膜过滤；树脂吸附；结晶
大观霉素（spectinomycin）是由大观链霉菌发酵产生的一种碱性水溶性抗生素，属氨基糖苷类抗生素（aminocyclitol）[1]，最初以大观盐的形式制成无菌悬浮注射剂应用于临床，目前多以盐酸盐形式制成注射剂使用[2]。

盐酸大观霉素为白色晶体，分子式C14H24N2O7? 2HCl?5H2O，分子量495.35，易溶于水和甲醇，不溶于丙酮等有机溶剂。

大观霉素是一种广谱性抗生素，主要对淋病奈瑟菌有高度抗菌活性[3]，其主要作用机制是与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质的翻译合成[2]。

但氨基糖苷类抗生素普遍存在肾毒性和耳毒性[4]，并且易产生耐药性[5]，因此在临床中多与其他抗生素联合使用。

大观霉素经微生物发酵产生，经过酸化、过滤、树脂交换、浓缩、结晶、干燥等过程得到合格的成品。

本文对大观霉素提取工艺进行优化，以过程收率和产品质量为指标，采用树脂吸附法对滤液进行吸附，采用膜过滤技术对解析液进行除杂和浓缩，以达到精简流程，高效提取，降低杂质的目的。

1 材料与方法 1.1材料 D152型和LK-12型弱酸性阳离子交换树脂，购自廊坊津南树脂有限公司，大观霉素发酵液：宁夏泰益欣生物科技有限公司自产。

1.2 仪器及设备
有机玻璃树脂柱：膜分离设备，50nm无机陶瓷膜，循环真空泵，旋转蒸发仪，高效液相色谱仪，真空干燥箱：太仓市实验设备有限公司。

1.3 分析方法 1.3.1大观霉素效价测定 HPLC-PAD法[6]。

1.3.2 可溶性蛋白测定
考马斯亮蓝法[7]。

1.4 实验方法
用草酸调节发酵液的ph至酸性，再由膜过滤进行预处理，去除发酵液中较大的杂质颗粒和部分菌丝体，然后使用离子交换树脂对滤液进行吸附（树脂体积为1000ml），吸附完成后用纯化水进行色素和蛋白等杂质的洗涤，再以盐酸为解析剂进行解析并结合成盐酸盐，最后使用纯度98%以上的丙酮进行结晶。

1.4.1 发酵液酸化条件优化
大观霉素发酵液ph 7.0左右，取5份500ml发酵液至烧杯中，分别用草酸调节pH至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，将折好的滤纸放置于漏斗上，漏斗下接100ml的量筒，将发酵液倒入漏斗中过滤，收集滤液，记录收集100ml滤液所用的时间，并将每一份滤液测其生物效价和可溶性蛋白含量。

1.4.2 发酵液膜过滤实验
将发酵液降温至18℃，用草酸调节ph至3.0，用50nm无机陶瓷膜过滤大观霉素发酵液，去除发酵液中的菌体及较大的杂质颗粒，控制过滤压力小于0.2KPa，滤速在10L/小时左右。

1.4.3 树脂吸附条件优化
用1.0mol/L NAoH回调ph至7.0，取30L复滤液分成3份，分别用1L的LK-12阳离子交换树脂和D152型阳离子交换树脂及DK110树脂进行吸附，吸附速率为1.2L/h，吸附完成后用纯化水冲洗树脂柱至无色，用1.0mol/L的盐酸进行解析，测定吸附废液的效价、解析液效价、体积及收率。

1.4.4 浓缩除杂
取1500ml的解析液两份，分别加入5%的活性炭，搅拌30min吸附除杂，然后用旋转蒸发仪旋蒸浓缩和纳滤膜浓缩，旋蒸温度50℃，转速50rpm/min，压力-0.78MPa，滤膜面积1.00m2，进膜压力0.35MPa，出膜压力0.25 MPa，最终浓缩液体积达到400ml即可，检测其浓缩液效价、色阶、及收率。

1.4.5 结晶
取浓缩液200ml，加入5%的活性炭再次吸附除杂，加入2倍、3倍、4倍、5倍体积的丙酮进行结晶，搅拌速率30rpm/min，抽滤、收集大观霉素结晶并干燥。

2 结果与讨论
2.1发酵液酸化实验
用3批实验考查不同ph下发酵液过滤的速率、大观霉素效价变化、可溶性蛋白含量，结果列于表1中。

表1 不同pH发酵液过滤速率、蛋白含量及效价
由表2可见，采用孔径为50nm的无机陶瓷膜对大观霉素发酵液进行过滤，平均脱色率为52.2%，平均脱蛋白率为66.4%，大观霉素收率为90.5%，且滤液为咖啡色透明液体，其中无任何固体颗粒残留，满足树脂的吸附条件。

2.3 不同树脂吸附及解析实验
从图2和图3中对比可以看出，旋蒸浓缩液和超滤浓缩液在结晶过程中加入3倍浓缩液体积的丙酮析出的晶体重量均明显多于其他倍数下晶体的重量，加入相同倍数丙酮进行析晶，超滤浓缩液的析晶率显著高于旋蒸浓缩液的析晶率，超滤浓缩液的析晶率达到78.75%，而旋蒸浓缩液的析晶率可达72.23%，另外，浓缩液的浓度越高，析晶过程中需要的丙酮倍数越低。

3 结论与讨论
（1）大观霉素发酵液酸化ph为3.0时，过滤速度最快，可达到12.19ml/min，大部分碱性大分子蛋白与酸反应发生沉淀，降低了滤液中可溶性蛋白含量，用无机陶瓷膜过滤能够是大观霉素滤液能更好的脱色并去除大分子量蛋白并且大观霉素收率可达90.5%，高于一般板框过滤。

（2）对比DK110、D152和LK12三种树脂的吸附速率。

吸附效果、解析液效价以及大观霉素收率，发现吸附相同体积的滤液时D152树
脂的吸附效果最好，吸附废液中残留的大观霉素含最少为430μ/ml，LK12效果次之，用1.0mol/L盐酸溶液解析树脂，发现D152树脂的解析液
效价最高为21035μ/ml，收率也最高，LK12树脂解析液的效价和收率次之。

而DK110树脂的pH下降最快，达到吸附底线，这可能是其吸附效果差的主要原因。

（3）对比负压高温旋蒸浓缩和超滤膜浓缩大观霉素脱色液发现，超滤膜浓缩收率比负压旋蒸的收率高出4.3%，并且浓缩液的效价明显高于旋蒸浓缩液，浓缩液的色度相对较浅。

两种浓缩液结晶过程中加入相同倍数的丙酮，超滤浓缩液析出的晶体重量均明显大于旋蒸浓缩液，其析晶率达到78.75%，而旋蒸浓缩液的析晶率可达72.23%，另外，浓缩液的浓度越高，析晶过程中需要的丙酮倍数越低。

参考文献：
[1]巫晓华.大观霉素与其他4中抗生素体外抗淋球菌活性比较[J].泰山医学院报。

2014（4）：287-289
[2]李清泉，王忠，林可霉素与大观霉素复方制剂的临床应用[J].兽医导刊，2012：96-97.
[3]何英，石仁琳.盐酸大观霉素、水剂青霉素治疗淋病100例疗效观察[J].世界罪行医学信息文摘，2015（13）：116.
[4]丁大连，Salvi Richard. 氨基糖苷类抗生素耳毒性研究[J]. 中华耳科学杂志.2007，5（2）：125-131.
[5]孙思，刘兰兰，佟立峰等.淋球菌对大观霉素耐药机制的研究进展[J]. 中国抗生素杂志，2019，44（02）：20-25.
[6]王琰，姚尚辰，王明娟等. HPLC-PAD法测定盐酸大观霉素含量及有关物质[A].中国抗生素杂志，2014，39（6：）：439-442
[7]王文平，郭祀远，李琳，等. 考马斯亮蓝法测定野木瓜多糖中蛋白质的含量[J]. 食品研究与开发，2008，29（1）：115-117.。