磁珠纯化DNA的原理

磁珠起源

磁珠目前广泛应用于NGS实验中，DNA、RNA的纯化，片段筛选……今天，我们就聊一聊磁珠。

首先说一下磁珠的起源：

磁珠的发明构想最初来自于挪威科技大学的化学家John Ugelstad，他在1976年以聚苯乙烯(Polystyrene)为主要材料，制造出均匀磁化的球体粒子。1979年Vogelstein等报道在高浓度碘化钠存在下玻璃粉末作为吸附剂用于从琼脂糖凝胶中提取DNA片段，而后基于硅胶和其他具有亲水性表面的载体的固相核酸纯化技术广泛发展起来（Vogelstein B,Gillespiet D. Proc A，1979,76(2):615～619）。基于磁性微粒的核酸纯化方法就是其中的一种

现代分子生物学和医学对高通量，高灵敏度，自动化操作的需求也是与日俱增，于是20世纪90年代，磁珠法DNA提取技术由此得到了大力发展。硅质膜磁珠是一类最早出现基于硅介质与核酸特异结合的原理而发展起来的的产品，它广泛应用于DNA、RNA的纯化。与离心柱法原理相同，离心柱法所采用的硅胶膜实际上就是玻璃纤维，而磁珠之所以能够结合核酸也是因为其表面包被了玻璃纤维。硅质膜二氧化硅磁珠具有超顺磁性内核和二氧化硅外壳，表面修饰大量的硅羟基。磁珠表面的硅羟基能够与溶液中的核酸通过氢键和静电作用发生特异性结合，在高盐条件下与核酸结合，而在低盐环境下被洗脱，这样就可以直接从复杂的生物体系中迅速分离核酸。

到现在纳米级别的磁珠发展已经各式各样了，表面性质各不相同，分离原理也不尽相同。

但基本上固态的球状材料组成并无太大差异，基础结构一般分为3层，最内层的核心是聚苯

乙烯、第二层包裹磁性物质——四氧化三铁（Fe3O4），最外层表面是官能基团修饰的高分

子材料所构成，其中官能基团行使与核酸结合的工作，提取、生物素捕获、片段筛选功能的

不同，表面官能基团不同。当然不仅磁珠应用在核酸制备上，在化学发光、细胞分选、蛋白

纯化等应用磁珠依然是大显身手，是因为不同的官能基团，或者偶联其它，如蛋白抗体等。

毋庸置疑，NGS上用的最多还是我们的老熟人——贝克曼的XP磁珠。这种羧化磁珠比

羟基磁珠产量更高，非特异性结合更少。XP磁珠采用SPRI（固相可逆固定化）技术：在较

高浓度的PEG和NaCl导致DNA分子水化层脱去，DNA胶体热力学稳定性破坏，构象也随之

改变，带负电荷的磷酸基团大量暴露在外面；带负电荷的磷酸基团通过Na+与羧基形成“电

桥”，使得DNA被特异吸附到带羧基的磁珠表面。同时由于磁珠具有超顺磁性，可以通过外加磁场进行收集操作。去上清后，磁珠可用酒精洗涤，最后用TE洗脱DNA。

SPRI成就了贝克曼尖端的磁珠纯化技术。这项技术是由人类基因组计划主要负责人之一Trevor Hawkins博士（美国能源部的人类基因组计划的前任主任）领导发明，用于人类基因组计划的样品准备工作。Trevor Hawkins博士也曾在西门子诊疗、皇家飞利浦电子公司和通用电气等企业担任高级主管人，在医疗保健领域工作了超过25年，他专注提升医疗技术与创新，贡献巨大，单说SPRI专利现在仍然是生命科学和诊断的磁珠应用领域中最重要的专利之一。

起初SPRI这个专利并不在贝克曼的手里，而是，在Agencourt公司手里。为了实现在生物医学方面实现核酸提取的自动化和高通量，在2005年贝克曼与Agencourt达成协议，以1.5亿美金的金额成功收购Agencourt公司。在实现了强强联合后，贝克曼在自动化核酸纯化领域至今一直引领，在NGS兴起后，XP磁珠被广泛用于文库构建工作中，而后贝克曼也推出专用的更为精准的片筛磁珠Agencourt SPRIselect。

顺便说一下，Agencourt公司是两个著名体系的开创者：Agencourt Bioscience的主营产品是用于生化医疗研究的核酸纯化产品。Agencourt还有另一个重要部门则是APG，发开基于磁珠的大规模并行克隆连接DNA测序法，2006年它被贝克曼1.2亿美元转卖给了ABI。贝克曼一直持有Agencourt品牌，2007年ABI依靠APG的技术也推出一款连接法的测序仪，是的，它就是号称二代测序碱基读取最准确的SOLiD系统。

当然说到XP，大家更好奇的是它片选筛选原理。

XP磁珠体系中包含：磁珠、聚乙二醇（PEG）、以及盐离子等，在一定浓度的PEG和盐离子环境中，DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面（即固相载体），该过程是可逆的，在适当条件下，结合的DNA分子可以被洗脱回收。构建过几次文库的，就很清楚自己要大多片段的文库，改用多少成XP去双选。

磁珠双选很大程度依赖于PEG。

PEG沉淀蛋白、沉淀DNA，DNA连接反应中低浓度PEG做为聚合剂，增强载体与目的片段碰撞的机会（很多公司的建库试剂盒接头连接后，如果要片段筛选，需要先纯化目的是去除PEG的影响。为了提高连接效率，连接Buffer含有一定的PEG）。这些都是分子生物学的经典实验，早已收录分子生物学的圣经——《分子克隆实验指南》。

PEG沉淀大分子是很久以前就发现，因为PEG能够通过吸涨作用，通过空间位置排斥效应，诱导水溶液的大分子聚合（MACROMOLECULAR CROWDING:Biochemical,Biophysical,and Physiological Consequences，1993）。而Lis是最早利用PEG按DNA分子大小沉淀DNA的，早在1975年发有文章。（Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol，Nucleic Acids Research，1975；Fractionation of DNA Fragments by Polyethylene Glycol Induced Precipitation，1980）